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【微課堂】環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計數(shù)方法

2024-8-27　　閱讀(203)

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 《藥品GMP指南》生物指示劑的應用中指出,，實驗室在接受商品化生物指示劑時,，應進行微生物數(shù)量測定。
那么,，環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑的總芽孢數(shù)是如何確定的呢,？接下來為大家分享泰林環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑Bacillus atrophaeus ATCC9372）的芽孢計數(shù)方法。

環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計數(shù)—操作方法 

隨機抽取需檢驗批次環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑取4片（支）放置于提前照過紫外的生物安全柜中（相關(guān)物品已放置于生物安全柜中）,，用酒精棉擦拭指示劑外表,，通風15min以上，后續(xù)操作如下：
注意：生物指示劑不要進行紫外照射,，可能會造成計數(shù)結(jié)果偏低?。?！
01 芽孢洗脫

在生物安全柜中,，取4片（支）生物指示劑打開，取出載體,，分別放置于含有3-4顆玻璃珠（直徑6mm）的無菌試管中,，向無菌試管中加入3mL的含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水,，置于渦旋混勻儀上充分振蕩，將試管中載體打散成纖維裝后,，再中加入7mL含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水,，震蕩30s，制成均一的菌懸液,，將該試管記為10-1,。
02 熱激活

將水浴鍋加熱至80℃-85℃，取上述試管,，放置于水浴鍋中熱激活10min,，熱激完成后，立即將芽孢懸液轉(zhuǎn)移至0-4℃的冰水浴中冷卻至室溫,。
03 梯度稀釋

將該試管轉(zhuǎn)移至生物安全柜中,，于旋渦混勻儀上旋渦30s，用移液槍吸取1mL芽孢懸液,，加入到另一根含有9mL含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水的試管中,，記為10-2，按照該方法依次稀釋至10-3,、10-4（稀釋級別按制造商提供的芽孢數(shù)量而定）,。
04 制備計數(shù)平皿

取芽孢數(shù)在30cfu/mL-300cfu/mL的稀釋級別的試管（10-4）震蕩30s，每支稀釋管平行制備2個平皿,，每皿加1mL菌懸液,，注入15mL-20mL溫度不超過45℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）。等待瓊脂凝固后,，倒置于30℃-35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h-72h后計數(shù),。

05 計算

總芽孢數(shù)cfu/片（支）=平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)。

06 判定標準

（Bacillus atrophaeusATCC9372）的菌落圓形,、凸面,、粗糙、不透明,，顏色呈淡黃色或淡橘色,，菌落生長狀態(tài)良好，單一,，無雜菌,。總芽孢數(shù)結(jié)果應在產(chǎn)品標示值的50%-300%范圍內(nèi),。

注意事項


1,、切勿將生物指示劑進行紫外照射消毒，建議對初級包裝進行擦拭,。

2,、環(huán)氧乙烷滅菌生物指示劑芽孢計數(shù)，建議使用含0.1%聚山梨酯80的無菌純化水進行稀釋,。

3,、吸取含紙質(zhì)載體的菌液時，避免纖維堵槍頭,，導致移液不準確,。

4、建議以單片（支）生物指示劑的形式進行計數(shù),，確保每片（支）生物指示劑計數(shù)結(jié)果均符合要求,。

5、建議使用玻璃珠（4mm-6mm）對紙質(zhì)載體進行打散處理,。

6,、芽孢計數(shù)過程中必須進行熱激活處理：溫度80℃-85℃，時間10min,。




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