RIPA 裂解液
MCE 國際站：RIPA Lysis Buffer (Strong)
品牌：MedChemExpress (MCE)
存儲條件： -20℃ 1 年
簡介：RIPA Lysis Buffer (Strong) 是一種傳統(tǒng)的細胞、組織快速裂解液,，適用于 Western Blot (WB),、免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 等實驗。
概述：MCE RIPA 裂解液 (Radio Immunoprecipitation Assay Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細胞,、組織快速裂解液,，根據(jù)其裂解強度大致可以分為強、中,、弱三類,。RIPA 裂解液適用于 Western Blot (WB)、免疫沉淀 (IP) 及免疫共沉淀 (Co-IP) 等實驗,，例如大部分抗原表位的檢測,、胞漿磷酸化蛋白和細胞核轉錄因子檢測等。MCE RIPA 裂解液 (強)的主要成分為 50 mM Tris (pH 7.4),，150 mM NaCl,，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate,，0.1% SDS,，以及 sodiumorthovanadate，EDTA 等,。RIPA 裂解液 (強) 不含全面的蛋白酶或磷酸酶抑制劑,。為有效的防止蛋白降解，建議添加全面的蛋白酶和磷酸酶抑制劑,。
描述：
MCE RIPA（放射免疫沉淀分析）裂解緩沖液（強）是一種廣泛用于報告基因分析,、蛋白激酶分析、免疫分析和蛋白質純化的裂解和洗滌緩沖液。
RIPA 裂解緩沖液（強）由 50 mM Tris（pH 7.4）,、150 mM NaCl,、1% Triton X-100、1% 脫氧膽酸鈉,、0.1% SDS 以及一般蛋白酶和磷酸酶抑制劑（例如,，偏釩酸鈉、氟化鈉,、EDTA）組成,。如果需要，可添加 MCE 蛋白酶抑制劑混合物（HY-K0010）和 MCE 磷酸酶抑制劑混合物（例如,，HY-K0021,、HY-K0022 和 HY-K0023）。
操作說明：1. 裂解細胞樣品1) 取適當量的裂解液,，如有需要,，在使用前數(shù)分鐘內加入 Protease Inhibitor Cocktail (HY-K0010)，Phosphatase Inhibitor Cocktails (HY-K0021,、HY-K0022,、HY-K0023)或 Deacetylase Inhibitor Cocktail (HY-K0030)，具體操作可參考相關產品說明書,。準備好置于冰上備用,。2) 貼壁細胞：a. 去除培養(yǎng)液，用預冷的 PBS,、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗 2 遍 (洗去血清中 IgG 干擾對 IP 和 Co-IP 實驗是有益的,，但對 WB 可能并非必要)。b. 按照 6 孔板每孔加入 150-250 μL 裂解液的比例加入預冷的裂解液,。用槍吹打數(shù)下,，使裂解液和細胞充分接觸。c. 冰上放置 5-10 分鐘,，期間劇烈震蕩 3-4 次,，每次 30 秒，以充分裂解,。懸浮細胞：a. 離心收集細胞,，棄上清，用預冷的 PBS,、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗 2遍 (洗去血清中 IgG 干擾對 IP 和 Co-IP 實驗是有益的，但對 WB 可能并非必要),。b. 按照 6 孔板每孔加入 150-250 μL 裂解液的比例加入預冷的裂解液,，再用手指輕彈以充分裂解細胞。充分裂解后應沒有明顯的細胞沉淀。如果細胞量較多,，必須分裝成 0.5-5 × 106 cells/管,，然后再裂解。c. 冰上放置 5-10 分鐘,，期間劇烈震蕩 3-4 次,，每次 30 秒，以充分裂解,。注：一般每 0.5-5 × 106 cells 用 1 mL 的 RIPA 裂解液裂解,。細胞數(shù)量較高時，可加大裂解液用量,。3) 充分裂解后,，14,000 g 低溫離心5 分鐘，取上清,，即可進行后續(xù)的WB,、IP 等操作。也可用液氮速凍后放 –80℃ 長期保存,。2. 裂解組織樣品1) 取適當量的裂解液,，如有需要，在使用前數(shù)分鐘內加入 Protease Inhibitor Cocktail (HY-K0010),，Phosphatase Inhibitor Cocktails (HY-K0021,、HY-K0022、HY-K0023)或 Deacetylase Inhibitor Cocktail (HY-K0030),，具體操作可參考相關產品說明書,。準備好置于冰上備用。2) 將組織置于小皿中,，冰上操作,，剪切成細小的碎片。3) 按照每 20 mg 組織加入 150-250 μL 裂解液的比例加入預冷的裂解液,。如果裂解不充分可以適當添加更多的裂解液,，如果需要高濃度的蛋白樣品，可以適當減少裂解液的用量4) 用玻璃勻漿器冰上均質 30-50 次,，或超聲破碎細胞,，每次 30 秒，3-4 次,，每次間隔 1 分鐘,，置于冰上冷卻。均質或超聲破碎細胞后應鏡檢,，細胞破碎率不小于 90%,，同時組織已經裂解，沒有明顯的小組織塊。5) 將勻漿物轉移到離心管,，冰上放置 5-10 分鐘,，期間劇烈震蕩 3-4 次，每次 30 秒,，以充分裂解,。6) 充分裂解后，14,000 g 低溫離心 5 分鐘,，取上清,，即可進行后續(xù)的PAGE、WB 和免疫沉淀等操作,。注：每 20 mg 凍存的小鼠肝臟組織用200 μL 本裂解液裂解后獲得的上清,，其蛋白濃度約為 15-25 mg/mL，不同狀態(tài)的不同組織有所不同,。
注意事項：1. 本品不含蛋白酶抑制劑 Cocktail,，需用戶自備。2. 裂解樣品的所有步驟都需要在冰上或 4°C 條件下進行,。3. 為取得最佳的使用效果,，盡量避免過多的反復凍融，可以適當分裝后使用,。4. 裂解液中 SDS 4°C 保存易沉淀析出,，使用前應該 37°C 水浴重新溶解后恢復到室溫使用。5. RIPA裂解緩沖液含有離子去污劑,，如果待測定的激酶易變性,，可能不適用。6. 在制備用于磷酸酶測定的裂解物時,，不要添加磷酸酶抑制劑,。7. 由于本品含有較高濃度的去垢劑，后續(xù)蛋白濃度測定不宜用 Bradford 法,，推薦選用 BCA 蛋白濃度測定試劑盒 (HY-K0401),。8. RIPA 裂解液的裂解產物中經常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物，屬于正?，F(xiàn)象,。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復合物。在不檢測和基因組 DNA 結合特別緊密的蛋白的情況下,，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗,；如果需要檢測和基因組結合特別緊密的蛋白，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物,，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗,。如果檢測一些常見的轉錄因子,，例如 NF-kappaB、p53 等時,，通常不必進行超聲處理，就可以檢測到這些轉錄因子,。9. 本產品僅限于專業(yè)人員的科學研究用,，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品,。10. 為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
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