一,、背景

機(jī)械負(fù)荷是工程心血管組織中組織特性的強(qiáng)大調(diào)節(jié)劑。為了最終調(diào)節(jié)生化過(guò)程，必須量化機(jī)械負(fù)荷對(duì)工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響,。，涂有聚-4-羥基丁酸酯（P4HB）的多孔聚乙醇酸（PGA）支架部分嵌入有機(jī)硅層中,，以允許心血管工程結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)期單軸循環(huán)機(jī)械應(yīng)變,。與未應(yīng)變構(gòu)建體相比，這些構(gòu)建體承受了兩種不同的應(yīng)變量級(jí),，并且在生化性能,、力學(xué)性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面表現(xiàn)出差異。結(jié)果表明,，當(dāng)組織暴露于長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械刺激時(shí),，會(huì)誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)比例的膠原蛋白的產(chǎn)生,。然而，以大應(yīng)變大小的應(yīng)變對(duì)組織的機(jī)械性能產(chǎn)生負(fù)面影響,。此外,，與構(gòu)建體的深層相比，動(dòng)態(tài)應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細(xì)胞和膠原蛋白的不同排列,。所提出的模型系統(tǒng)可用于系統(tǒng)地優(yōu)化工程心血管組織的培養(yǎng)方案,。

機(jī)械調(diào)節(jié)對(duì)細(xì)胞生物合成活性的影響已經(jīng)在二維和三維培養(yǎng)條件下進(jìn)行了研究，并且這種效果取決于ECM的性質(zhì),。 通過(guò)使用各種培養(yǎng)系統(tǒng)（例如縱向拉伸裝置和真空驅(qū)動(dòng)裝置）刺激細(xì)胞,。 已經(jīng)進(jìn)行了幾項(xiàng)研究，著眼于機(jī)械刺激對(duì)復(fù)雜幾何形狀的組織重塑的影響,。在定義明確的簡(jiǎn)單幾何中進(jìn)行了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn),。 塞利克塔等培養(yǎng)的。成纖維細(xì)胞填充的膠原凝膠（管狀構(gòu)建體）在存在下精確控制變形,。只有有限數(shù)量的研究集中在明確定義的機(jī)械負(fù)荷對(duì)工程心血管組織特性的影響,，其中研究了ECM的從頭形成（例如，用細(xì)胞接種的聚乙醇酸（PGA）支架）,。需要對(duì)工程結(jié)構(gòu)中的組織特性進(jìn)行機(jī)械控制,。這需要詳細(xì)研究明確定義的加載條件對(duì)ECM合成和ECM組織的影響，以?xún)?yōu)化加載方案,。

二,、材料和方法

細(xì)胞和組織培養(yǎng)

人隱靜脈細(xì)胞（HSVC，肌成纖維細(xì)胞）取自一名44歲的女性,，并使用常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法生長(zhǎng),。44細(xì)胞在由先進(jìn)的Dulbecco改良鷹培養(yǎng)基補(bǔ)充有10%胎牛血，1%l-谷氨酰胺和0.1%慶大霉素,。

將支架真空干燥48小時(shí),，然后暴露于紫外線(xiàn)下1小時(shí)，隨后置于70%乙醇中4-5小時(shí)以獲得無(wú)菌,。讓支架干燥過(guò)夜,，然后用磷酸鹽緩沖鹽水。在細(xì)胞接種之前,，將組織培養(yǎng)基加入支架中16小時(shí)以促進(jìn)細(xì)胞附著,。使用纖維蛋白凝膠作為細(xì)胞載體，將第7代的HSVC細(xì)胞接種在這些支架上,。細(xì)胞以每厘米約20萬(wàn)個(gè)細(xì)胞的濃度接種隨后將組織構(gòu)建體在組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)（在37°C和5%CO2).組織培養(yǎng)基每3-4天更換一次,，由補(bǔ)充有10%FBS，1%l-谷氨酰胺，0.3%慶大霉素和l-抗壞血酸2-磷酸,。

應(yīng)變拉伸

將工程心血管構(gòu)建體培養(yǎng)3周,，包括6天無(wú)施加負(fù)荷以使細(xì)胞在接種后適應(yīng)，然后以2 Hz的頻率進(jìn)行1周的動(dòng)態(tài)應(yīng)變,。應(yīng)用三種不同的應(yīng)變條件：0%應(yīng)變,，4%動(dòng)態(tài)應(yīng)變和8%動(dòng)態(tài)應(yīng)變（n = 8）。在以4%和8%應(yīng)變的單獨(dú)樣品上進(jìn)行所施加應(yīng)變的測(cè)量2周和3周（n = 6）,。

機(jī)械測(cè)試

培養(yǎng)3周后犧牲構(gòu)建體,，并在1小時(shí)內(nèi)測(cè)試其機(jī)械性能（n = 6）。從樣品中除去有機(jī)硅層,，并將剩余的組織置于組織培養(yǎng)基中以滋潤(rùn)樣品,。樣品的厚度和寬度使用以下命令測(cè)定 Plμ 2300 非接觸式光學(xué)圖像輪廓儀。代表面積為 8.35 × 7.85 mm2使用5×物鏡以1×的掃描速度進(jìn)行掃描,。通過(guò)對(duì)代表性區(qū)域求平均值來(lái)獲得厚度和寬度,。

組織形成的生化測(cè)定

三、結(jié)果

循環(huán)應(yīng)變對(duì)組織性質(zhì)的影響

表征不同應(yīng)變大小對(duì)工程心血管組織特性,、構(gòu)建體的切線(xiàn)剛度以及 DNA,、GAG、膠原蛋白和 HP 交聯(lián)量的影響（表1）被量化,。相對(duì)于未應(yīng)變的工程組織構(gòu)建體，循環(huán)菌株不會(huì)增加工程組織構(gòu)建體中每干重的DNA量,。然而,，與未過(guò)濾的組織結(jié)構(gòu)相比，機(jī)械應(yīng)變結(jié)構(gòu)體中每 DNA 的膠原蛋白和每 DNA 的 GAG 顯著降低,。另一方面,，在兩種應(yīng)變條件下，每個(gè)三螺旋的HP交聯(lián)數(shù)量顯著增加,。4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的切線(xiàn)剛度等于未應(yīng)變組織結(jié)構(gòu)的剛度,，而8%應(yīng)變結(jié)構(gòu)相對(duì)于未應(yīng)變結(jié)構(gòu)和4%應(yīng)變結(jié)構(gòu)的剛度均顯著降低（圖）。4).

細(xì)胞拉伸

圖4

3周齡工程心血管結(jié)構(gòu)的切線(xiàn)剛度（MPa）作為不同應(yīng)變大小的函數(shù),。*表示與參考條件 0% （*p < 0.05） 的顯著差異,，表示與 4% 加載條件 （p < 0.05） 的顯著差異++

四、討論

機(jī)械負(fù)荷是活組織內(nèi)生化過(guò)程的重要調(diào)節(jié)器,。為了調(diào)節(jié)這些生化過(guò)程,，必須量化機(jī)械負(fù)荷對(duì)工程心血管結(jié)構(gòu)特性的影響。在這項(xiàng)研究中,，提出了一個(gè)實(shí)驗(yàn)框架,，其中使用應(yīng)變系統(tǒng)的改編版本在一次實(shí)驗(yàn)中同時(shí)對(duì)單個(gè)樣品施加各種應(yīng)變量級(jí)。系統(tǒng)可實(shí)現(xiàn)高通量的樣品,，并且易于長(zhǎng)時(shí)間保持無(wú)菌狀態(tài),。多孔PGA / P4HB支架部分嵌入有機(jī)硅層中,，允許這些結(jié)構(gòu)的重復(fù)和單軸長(zhǎng)期機(jī)械應(yīng)變。這些構(gòu)建物附著在Bioflex孔（美國(guó)Flexcell Int. Corp.）上,，經(jīng)受兩種不同的應(yīng)變量級(jí)數(shù)周,，與未應(yīng)變的構(gòu)建物相比，在生化性能,、機(jī)械性能和微觀結(jié)構(gòu)組織方面顯示出差異,。結(jié)果表明，長(zhǎng)時(shí)間的機(jī)械刺激誘導(dǎo)具有較高交聯(lián)分?jǐn)?shù)的膠原蛋白的產(chǎn)生,，從而改善了膠原蛋白的內(nèi)在機(jī)械性能,。然而，過(guò)大的應(yīng)變導(dǎo)致應(yīng)變對(duì)組織的機(jī)械性能產(chǎn)生不利影響,。此外,，與構(gòu)建體的深層相比，應(yīng)變誘導(dǎo)了表層中細(xì)胞和膠原蛋白的不同排列,。

為了能夠拉伸三維工程心血管結(jié)構(gòu),，模型系統(tǒng)得到了進(jìn)一步發(fā)展。組織結(jié)構(gòu)的組成部分之一是涂有P4HB的PGA,，以前沒(méi)有表現(xiàn)出彈性材料行為,。因此，部分多孔PGA支架嵌入在一層薄薄的液態(tài)硅膠中,。這允許對(duì)這些工程組織進(jìn)行動(dòng)態(tài)拉伸,。在培養(yǎng)2周（1周菌株）后驗(yàn)證應(yīng)變場(chǎng)，支撐有機(jī)硅層的存在導(dǎo)致工程結(jié)構(gòu)的彈性響應(yīng),，這可以通過(guò)在培養(yǎng)2周后保留最初施加的應(yīng)變的事實(shí)來(lái)說(shuō)明,。然而，3周后的應(yīng)變分布無(wú)法確定為結(jié)構(gòu)與支撐有機(jī)硅層部分分離,，這大約對(duì)應(yīng)于PGA機(jī)械完整性的損失,。 雖然應(yīng)變沒(méi)有確定，但動(dòng)態(tài)成分仍然存在,。這意味著受控應(yīng)變最終可以在 2.5-3 周的時(shí)間內(nèi)應(yīng)用,。對(duì)不同應(yīng)變場(chǎng)的分析表明，平均應(yīng)變構(gòu)成了所施加的應(yīng)變,，對(duì)無(wú)組織構(gòu)建的膜進(jìn)行了驗(yàn)證,。然而，組織結(jié)構(gòu)的應(yīng)變分布更加不均勻,?？赡埽痪鶆虻淖冃慰梢詺w因于由不均勻的組織形成引起的不均勻的組織特性。設(shè)置的限制是組織形成（圖,。5A-C）由于有機(jī)硅層存在下?tīng)I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)減少而收縮到結(jié)構(gòu)表面,。

在本研究中，動(dòng)態(tài)應(yīng)變對(duì)增殖沒(méi)有影響,。動(dòng)態(tài)菌株和未菌株構(gòu)建體之間每干重的DNA量沒(méi)有差異,。以前，在相對(duì)長(zhǎng)期的研究中,，細(xì)胞增殖不受機(jī)械負(fù)荷的影響,。2，28,，38 然而,，Mol等人。38確實(shí)顯示出自由浮動(dòng)工程心血管結(jié)構(gòu)的增殖水平升高,，這些結(jié)構(gòu)不受機(jī)械約束,。必須認(rèn)識(shí)到，在這項(xiàng)研究中,，未應(yīng)變的結(jié)構(gòu)并非沒(méi)有壓力,。HSVC屬于肌成纖維細(xì)胞表型25，38,，這些肌成纖維細(xì)胞產(chǎn)生連續(xù)的等長(zhǎng)張力,。24 由于工程結(jié)構(gòu)被支撐硅膠層限制為收縮，因此在結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生了內(nèi)部張力,。（?。┏衫w維細(xì)胞收縮產(chǎn)生的內(nèi)部應(yīng)力足以限制細(xì)胞增殖。

體內(nèi)活細(xì)胞存在于動(dòng)態(tài)的生理環(huán)境中,，受到廣泛的機(jī)械刺激，包括拉伸,、壓縮,、剪切應(yīng)力和流體靜壓力等。然而在一般的體外培養(yǎng)和分析條件下,，細(xì)胞沒(méi)有受到來(lái)自生長(zhǎng)環(huán)境的力學(xué)刺激,。通過(guò)國(guó)產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀，可以提供與體內(nèi)細(xì)胞相似的生理環(huán)境,，幫助研究人員分析各種細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用中的拉伸負(fù)荷的生化變化,，包括肌肉、肺,、心臟,、血管、皮膚等。

詳情介紹

國(guó)產(chǎn)細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力加載系統(tǒng)

CELL TANK

國(guó)產(chǎn)細(xì)胞牽張拉伸應(yīng)力培養(yǎng)系統(tǒng)

技術(shù)背景：

當(dāng)前細(xì)胞基礎(chǔ)研究以二維靜態(tài)培養(yǎng)為主,，這種平面培養(yǎng)與實(shí)際“動(dòng)態(tài)+立體"模式差別很大，導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分化,、細(xì)胞間相互作用與體內(nèi)動(dòng)態(tài)環(huán)境產(chǎn)生明顯差異,。比如細(xì)胞骨架重組、細(xì)胞形態(tài)以及基因蛋白表達(dá)改變等,。

細(xì)胞牽張系統(tǒng)將帶來(lái)跨領(lǐng)域的創(chuàng)新：

●動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前更可靠的評(píng)估

細(xì)胞拉伸儀腔體

●干細(xì)胞分化機(jī)制

●機(jī)械刺激力與癌癥的相關(guān)性

●生醫(yī)材料與細(xì)胞動(dòng)態(tài)特性研究

●體外疾病微環(huán)境的快速建立

CellTank一體式細(xì)胞牽張拉伸培養(yǎng)系統(tǒng)

CELL TANK為細(xì)胞和組織模型提供機(jī)械拉伸條件的平臺(tái),。

國(guó)產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀

CELL TANK為細(xì)胞牽張系統(tǒng)使科學(xué)家能夠輕松而精確地將仿生機(jī)械應(yīng)變應(yīng)用于細(xì)胞和組織。

國(guó)產(chǎn)細(xì)胞拉伸儀

預(yù)埋橫桿式培養(yǎng)腔室

拉伸腔體共有三款 分別為32*32mm,；20*20mm,；10*10mm

拉伸腔體

可視化圖形操作界面

細(xì)胞拉伸儀界面

細(xì)胞拉伸儀界面

HOW TO USE

1. 細(xì)胞外基質(zhì)涂層進(jìn)行預(yù)處理，將細(xì)胞接種到腔室中,，細(xì)胞粘附在基底上,，開(kāi)始過(guò)夜培養(yǎng)過(guò)程。

2. 細(xì)胞增殖后,，選擇拉伸模式并開(kāi)始循環(huán)刺激,。

3. 根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)收獲/處理細(xì)胞，分析數(shù)據(jù),。

優(yōu)勢(shì)

· 均勻負(fù)載

培養(yǎng)腔室采用預(yù)埋橫桿技術(shù),，保證每個(gè)細(xì)胞都沿著拉伸軸均勻地承受應(yīng)變，非軸向方向上的次級(jí)載荷極低

· 高再現(xiàn)性

高精度步進(jìn)電機(jī)保證在各種速度和拉伸比組合中實(shí)現(xiàn)一致的運(yùn)動(dòng)程序,，機(jī)械穩(wěn)定性與拉伸膜的*彈性相結(jié)合,，保證高度可重復(fù)的力學(xué)刺激

· 一體式控制

自帶觸摸控制屏，無(wú)需電腦,。內(nèi)置ARM芯片,，高效穩(wěn)定運(yùn)行的同時(shí)簡(jiǎn)單易用

· 多樣的拉伸模式

靈活配置不同牽張加載周期、大小,、頻率,、持續(xù)時(shí)間，靜態(tài)保持,、正弦波形,、三角波形、矩形以及各種特制波形

· 高通量培養(yǎng)腔室

有效拉伸面積32×32mm,，PDMS材質(zhì)基底適配各種實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù),，包括細(xì)胞固定和熒光成像等

設(shè)備參數(shù)

外形尺寸 350x330x110 mm主機(jī)重量 3 kg拉伸腔體 4個(gè)，32x32 mm / 8個(gè),，20x20 mm控制模式 三角波,、正弦波,、方波及其組合最大應(yīng)變率 30%最高拉伸速率 30 mm/s最高循環(huán)頻率 2 Hz基底膜厚度 0.2 mm使用環(huán)境 CO2培養(yǎng)箱

橫桿拉伸技術(shù)局部應(yīng)變率更均勻

拉伸腔有限元分析

免費(fèi)試用三個(gè)月

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