大鼠內(nèi)皮素(ET)酶聯(lián)免疫分析(ELISA)

試劑盒使用說明書

本試劑僅供研究使用

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實(shí)驗(yàn)目的：

本試劑盒用于測定大鼠血清,、血漿,、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中內(nèi)皮素(ET)的含量。

實(shí)驗(yàn)原理：

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定大鼠標(biāo)本中內(nèi)皮素(ET)水平,。用純化的內(nèi)皮素(ET)捕獲抗體包被微孔板,，制成固相抗體，往包被的微孔中依次加入內(nèi)皮素(ET),，再與HRP標(biāo)記的檢測抗體結(jié)合,，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物,，經(jīng)過C底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的內(nèi)皮素(ET)呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（OD值）,，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中內(nèi)皮素(ET)含量,。

試劑盒組成：

樣本處理及要求：
1、組織標(biāo)本：對(duì)于樣本要求保持鮮重,，稱取樣本中的重量不小于50mg,，一般以1g為基準(zhǔn),但不嚴(yán)格要求固定樣本每個(gè)重量必須達(dá)到相同的水平。勻漿的比例選取10%,，相當(dāng)于1g組織加9ml的勻漿液來進(jìn)行勻漿,。勻漿液選取PBS（PH=7.2-7.4，濃度為0.01mol/L）,。勻漿過程選用組織勻漿器,，冰浴上勻漿。(或者進(jìn)行液氮碾磨),，離心取上清,，離心轉(zhuǎn)速選用5000轉(zhuǎn)每分，時(shí)間是15分鐘,。取上清液待檢,。

2-1,、貼壁細(xì)胞用冷的PBS輕輕清洗，然后用胰蛋白酶消化,，1000×g離心5分鐘后收集細(xì)胞,；懸浮細(xì) 胞可直接離心收集。收集的細(xì)胞用冷的PBS 洗滌3次,。每 1×106 個(gè)細(xì)胞中加入150-200μL PBS重懸并通過反 復(fù)凍融使細(xì)胞破碎(若含量很低可減少PBS的體積),。將提取液于1500×g離心10分鐘，取上清檢測,。

2-2超聲波破碎條件：用20kHz頻率,，150W的功率，在冰浴中進(jìn)行超聲波破碎,，每破碎2s,，間隔3s，反復(fù)破碎三次,。

2-3反復(fù)凍融：收集細(xì)胞懸液,，4℃低溫離心（3000rpm，5min）,，棄上清,，加入一定量PBS（200ul）,，輕輕吹打混勻,，-20℃ 冷凍30 min，37℃解凍,，如此反復(fù)3次,，可形成細(xì)胞裂解液。

3,、標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取,，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn),，可將標(biāo)本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

4,、不能檢測含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

操作步驟

1. 標(biāo)準(zhǔn)品的加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL,。

2. 加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）,、待測樣品孔,。在酶標(biāo)包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl,，然后再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部,，盡量不觸及孔壁,，輕輕晃動(dòng)混勻。

3. 加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑100μl,，空白孔除外,。

4. 溫育：用封板膜封板后置37℃溫育60分鐘。

5. 配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用,。

6. 洗滌：小心揭掉封板膜,，棄去液體，甩干,，每孔加滿洗滌液,，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次,，拍干,。

7. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl,，輕輕震蕩混勻,，37℃避光顯色15分鐘。

8. 終止：每孔加終止液50μl,，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）,。

9. 測定：以空白孔調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）,，測定應(yīng)在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行,。

計(jì)算：

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo),，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù),；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式,，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度,，再乘以稀釋倍數(shù),，即為樣品的實(shí)際濃度。

注意事項(xiàng)：

1. 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,，酶標(biāo)包被板開封后如未用完,，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。樣本在使用前也要在室溫平衡60分鐘,。

2. 濃洗滌液可能會(huì)有結(jié)晶析出,，稀釋時(shí)可在水浴中加溫助溶,，洗滌時(shí)不影響結(jié)果。

3. 各步加樣均應(yīng)使用加樣器,，并經(jīng)常校對(duì)其準(zhǔn)確性,，以避免試驗(yàn)誤差。一次加樣時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi),，如標(biāo)本數(shù)量多,，推薦使用排槍加樣。

4. 請每次測定的同時(shí)做標(biāo)準(zhǔn)曲線,，最好做復(fù)孔,。如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標(biāo)準(zhǔn)品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定,，計(jì)算時(shí)請最后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）,。

5. 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染,。

6. 底物請避光保存,。

7. 嚴(yán)格按照說明書的操作進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果判定必須以酶標(biāo)儀讀數(shù)為準(zhǔn).

8. 所有樣品,，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理,。

9. 本試劑不同批號(hào)組分不得混用。

技術(shù)提示：

1,、混合蛋白溶液時(shí),，避免起泡。

2,、加校準(zhǔn)品與樣本時(shí),，每個(gè)校準(zhǔn)品濃度和樣本都要更換移液槍頭,，公共組分應(yīng)該懸臂加樣,，避免交叉污染。

3,、合適的溫育時(shí)間,，和充分的洗滌步驟，是保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必要條件,。

4,、底物溶液為無色液體，保存過程中變?yōu)樗{(lán)色,，代表底物溶液已經(jīng)失效,，不得使用。

5,、終止液加樣順序與底物溶液加樣順序一致,，加入終止液后,，藍(lán)色底物產(chǎn)物，會(huì)瞬間變?yōu)辄S色,。

6,、實(shí)驗(yàn)中，用剩的板條,，應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存,。

7,、所有液體組分,，使用前充分搖勻,，嚴(yán)格按照說明書標(biāo)明的時(shí)間、加樣量及加樣順序進(jìn)行溫育操作,。

8,、檢測必須符合實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范的規(guī)定，嚴(yán)格防止交叉污染,，所有樣品,、洗棄液和各種廢棄物都應(yīng)按照傳染物進(jìn)行處置,。

試劑盒性能：

1. 樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

2. 批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% ,。

保存條件及有效期：

1. 試劑盒保存：2-8℃

2．有效期：6個(gè)月