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  BCA蛋白定量試劑盒

貨號：B5000

保存條件： BCA試劑A和B室溫保存，蛋白標(biāo)準(zhǔn)請-20℃凍存。

產(chǎn)品簡介：

目前世界上常用的蛋白濃度檢測方法是：BCA 蛋白定量試劑盒(BCA Protein Assay Kit)和 Bradford 蛋白定量試劑盒(Bradford Protein Assay Kit),。BCA 法與傳統(tǒng)方法相比更簡單、更穩(wěn)定,、更靈敏度,。BCA 法測定蛋白濃度兼容性亦很好，不受大部分樣本中其他成分的影響,，對于 5%以內(nèi)的 SDS,、Triton X-100、Tween 20,、Tween 80 具有很好的兼容性,但 BCA 法測定蛋白濃度易受螯合劑,、高濃度的還原劑等的影響，在 BCA 法測定蛋白濃度前應(yīng)盡量使：EDTA 濃度≤10mM,，DTT 濃度≤1mM,，2-ME≤0.01%。

BCA Protein Assay Kit 在 50～1000μg/ml 濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系,，其最小檢出量為 25μg/ml,。

本試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途,。

產(chǎn)品組成：

試劑(A): BCA 試劑A      100ml

試劑(B): BCA 試劑 B      3ml

試劑(C): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)    20mg

試劑(D): 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液   10ml

自備材料：

1,、酶標(biāo)儀或分光光度計

2、96 孔板或 EP 管

3,、恒溫箱或水浴鍋

操作步驟(僅供參考)：

1,、取 1ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液wan全加入到含有 20mg 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)中，充分溶解后配制成

20mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,，配制后可立即使用,，配制的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液應(yīng)-20℃保存。

2,、取適量的 20mg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,，稀釋至終濃度為 500μg/ml 或所需濃度。如取 25μ l 蛋白標(biāo)準(zhǔn)(20mg/ml),，加入 975μl 稀釋液,，充分混勻即配制成 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液,。

注意：待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中,，一般可用 0.9%NaCl 或 PBS 作為溶解 BSA 稀釋液,，稀釋后的 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液也應(yīng)-20℃長期保存。

3,、根據(jù)樣品數(shù)量,，按試劑(A):試劑(B)=50:1 的比例配制 BCA 工作液，即取 50 份 BCA 試

劑 A 和 1 份 BCA 試劑B,，充分混勻,，即獲得 BCA 工作液(注意：正常 BCA 工作液應(yīng)為蘋果綠或墨綠色，如變?yōu)樽仙蚱渌伾珣?yīng)棄用),。

例如:取5ml BCA 試劑 A 和0.1ml BCA 試劑 B,，配制成 5.1ml BCA 工作液，BCA 工作液室溫 24 小時內(nèi)穩(wěn)定,。

4,、將 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按 0、1,、2,、4、8,、12,、16、20μl 加到 96 孔板或 EP 管中,， 加稀釋液補(bǔ)足至 20μl,，其蛋白標(biāo)準(zhǔn)濃度依次為 0、25,、50,、100、200,、300,、400、500μg/ml,。

5,、加 20μl 待測蛋白到 96 孔板或 EP 管中，如果樣本不足 20μl,，用稀釋液補(bǔ)足至 20μl,。注意：如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液不同，應(yīng)在待測蛋白中加入 20μl 稀釋液；如果標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液與溶解待測蛋白的溶液相同,，無需在待測蛋白孔中加入 20μl 稀釋液,，以減少不同溶液的差異。

6,、向各孔或 EP 管加入 200μl 配制好的 BCA 工作液,，37℃孵育 20～30min。

7,、酶標(biāo)儀或分光光度計測定 562nm 波長處吸光度(如無 562nm，540～595nm 之間的波長也可),，各孔或 EP 管吸光度減去未加 500μg/ml 蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度,，以求得的差值為縱坐標(biāo)：以標(biāo)準(zhǔn)孔或 EP 管中蛋白濃度(μg/ml)為橫坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程,， 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出待測樣品的蛋白濃度,。

注意事項：

1、蛋白標(biāo)準(zhǔn)(BSA)粉末溶解于蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液后,，即獲得蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液(即 20mg/ml 的蛋白標(biāo)準(zhǔn)),，該原液中含有防腐劑，不影響后續(xù)檢測,，該蛋白標(biāo)準(zhǔn)原液-20℃長期保存,。

2、待測蛋白溶解于什么樣的稀釋液中,，蛋白標(biāo)準(zhǔn)也宜溶解于什么樣的稀釋液中,，否者待測蛋白與蛋白標(biāo)準(zhǔn)中所含非蛋白成分不一致，有可能導(dǎo)致測定不準(zhǔn)確,。

3,、如果檢測效果不佳，可以室溫放置 2h 或 60℃放置 30min,，顏色會隨著時間的延長不斷加深,，顯色反應(yīng)也會隨溫度升高而加快；如果濃度較低,，可以適當(dāng)延長孵育時間或在較高溫度下孵育,。

4、測定標(biāo)準(zhǔn)曲線時發(fā)現(xiàn)隨著標(biāo)準(zhǔn)品濃度的增加吸光度或顏色沒有明顯變化,，可能的原因是樣品中含有嚴(yán)重干擾 BCA 法測定蛋白濃度的物質(zhì),。

5、BCA 法檢測時,，待測樣本中不應(yīng)含有EGTA,，否則影響檢測結(jié)果。

6、因 BCA 法測定時顏色會隨著時間的延長不斷加深,，建議每次測定時都作標(biāo)準(zhǔn)曲線,，且顯色反應(yīng)的速度和溫度有關(guān)，所以除非精確控制顯色反應(yīng)的時間和溫度,，否則每次都做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

7、如果沒酶標(biāo)儀,，也可用普通分光光度計測定,，但應(yīng)考慮根據(jù)比色皿的最小測定體積，應(yīng)按比例適當(dāng)加大 BCA 工作液的用量使總體積不小于最小檢測體積,，樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的用量亦相應(yīng)按比例放大,；使用分光光度計測定蛋白濃度時，可以測定的樣品數(shù)量可能會顯著減少,，Lablead 建議把系列標(biāo)準(zhǔn)品用量增加至 100μl,，BCA 工作液用量增加至 1ml。

8,、為了加快 BCA 法測定蛋白濃度的速度可以適當(dāng)加熱,，但是切勿過熱，否則易失效,。