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Protein G agarose

貨號：P0232

儲存條件：4℃保存，有效期一年,。請勿冷凍。

產(chǎn)品描述

本Protein G Agarose主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP),，也可用于抗體的純化,。

Protein G是C型或G型鏈球菌(Streptococcal bacteria)表達的免疫球蛋白結(jié)合蛋白。Protein A和Protein G功能相似,，能特異性地與哺乳動物免疫球蛋白 (Immunoglobulin, Ig)結(jié)合,，結(jié)合的部位通常為免疫球蛋白的Fc區(qū),，但有資料顯示Protein A也會和人VH3家族的Fab區(qū)結(jié)合，而Protein G有時與Fab區(qū)也有一定結(jié)合,。同時,，兩者對于不同的免疫球蛋白亞類的結(jié)合能力有所不同。適當(dāng)重組改造的 Protein G與瓊脂糖凝膠(agarose)以一定的方式結(jié)合,，可用于免疫沉淀或抗體的純化,。

Protein G Agarose適合于免疫沉淀human IgG1、IgG2,、IgG3,、IgG4，mouse IgG1,、IgG2a,、IgG2b、IgG3,，rat IgG1,、IgG2a、IgG2b,、IgG2c,，以及rabbit、goat多克隆抗體,。

本產(chǎn)品中的Protein G可與多數(shù)哺乳動物IgG的Fc端特異性結(jié)合,，分子量為22KDa。該重組Protein G通過改造,，僅保留了與IgG Fc端結(jié)合相關(guān)的氨基酸序列,，去除了結(jié)合位點以外可能導(dǎo)致非特異性結(jié)合的序列，從而可以有效減少非特異性結(jié)合,。每個Protein G分子可結(jié)合3個IgG分子,。

本產(chǎn)品中Protein G共價連接到4%的高交聯(lián)度、高流速瓊脂糖上,。每ml Protein G agarose beads (沉淀物)可以結(jié)合超過40mg human IgG,。本產(chǎn)品中agarose beads的直徑為45-165μm，抗體純化時的推薦線性流速為50-300cm/h,，耐壓指數(shù)最高為0.45MPa,。Protein G Agarose 如用于常規(guī)的免疫沉淀，每ml本產(chǎn)品(沉淀和溶液為1:3的混合物)可以免疫沉淀50次,。

注意事項

1.請勿冷凍保存本產(chǎn)品,。

2.Protein G Agarose使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻,。

3.本產(chǎn)品含有微量的防腐劑,，不會影響常規(guī)的免疫沉淀和抗體純化,。但如果后續(xù)涉及酶活性測定，使用本產(chǎn)品前宜先用TBS等適當(dāng)溶液洗滌Protein G agarose beads三次,，以充分消除防腐劑可能產(chǎn)生的干擾,。

4.從蛋白樣品收集開始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4度或冰上操作,。

5.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用,，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品,，不得存放于普通住宅內(nèi),。

6.為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作,。

使用說明:

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：

a. 蛋白樣品的準(zhǔn)備：

(a) 對于10cm細胞培養(yǎng)皿中的貼壁細胞,，吸除細胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次,，然后加入500ul至2ml細胞裂解液裂解細胞,。可使用LABLEAD生產(chǎn)的Western及IP細胞裂解液（Cat:W0013）或各種RIPA裂解液（Cat：R1090/R1091）等進行細胞的裂解,。

(b) 對于組織樣品參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解,。

(c) 對于懸浮細胞，離心收集細胞后,，PBS洗滌一次,，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解。

注：詳細的裂解方法參考不同裂解液的詳細使用方法,。對于不同的培養(yǎng)器材,，參考10cm培養(yǎng)皿的裂解液的用量進行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高,，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋,，如果蛋白樣品濃度過低,，在以后的裂解過程中適當(dāng)減少裂解液的用量,。

b. 去除非特異性結(jié)合(可選做)：

(a) 取200ul至1ml蛋白樣品，蛋白量約為200ug至1mg,，加入約1ug和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG 和20ul充分重懸的Protein G Agarose,，4oC緩慢搖動30min至2h。

(b) 2500rpm(約1000g)離心5min,，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀,。

注：所謂種屬相同的IgG是指后續(xù)免疫沉淀時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG,，如無normal IgG,，可以加入其它不影響后續(xù)檢測的其它mouse IgG類型的抗體,。通過和normal IgG和Protein G Agarose的孵育，可以充分降低非特異性的結(jié)合,，降低背景,。

c. 免疫沉淀：

(a) 加入0.2-2ug用于免疫沉淀的一抗，4oC緩慢搖動過夜,。

(b) 再加入20ul充分重懸的Protein G Agarose,，4oC緩慢搖動1-3h(為方便后續(xù)的洗滌操作，可以把加入充分重懸的Protein G Agarose的量調(diào)整為40ul),。

(c) 2500rpm(約1000g)離心5min,，或瞬時高速離心，小心吸除上清,，注意可留下少量上清但也不能吸掉Protein G Agarose,。

(d) 用準(zhǔn)備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1ml,。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同步驟(c),。

(e) 完成最后一次洗滌后，去除上清,，加入20-40ul 2X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀,，瞬時高速離心把樣品離心至管底。

(f) 100oC或沸水浴處理3-5min,，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳,，暫時不用的樣品可以-20oC保存。

2. 免疫共沉淀：

參考免疫沉淀的方法進行,，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品,。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳,。

3. 抗體純化：

a. 準(zhǔn)備工作：

(a) 用0.45um或0.2um孔徑的濾膜過濾所用的溶液,。

(b) 所有的溶液必須用超聲等方法脫氣(degas)。

(c) 選擇適當(dāng)?shù)募兓?，用適當(dāng)量的Protein G Agarose裝填純化柱,。也可使用LABLEAD的預(yù)裝柱產(chǎn)品。

(d) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌并平衡純化柱,，流速可以用恒流泵控制為1ml/min (1ml預(yù)裝柱),。如無恒流泵，也可以完quan依靠重力洗滌并平衡純化柱,。

b. 抗體純化：

(a) 把含有待純化的抗體上樣到純化柱,。

(b) 待純化的抗體過柱后，用10-20倍柱體積的TBS洗滌，以去除未結(jié)合和非特異性結(jié)合的蛋白,。洗滌是否完quan可以通過測定280nm的吸光度進行確定,。

(c) 洗滌完后，用10ml 50mM glycine,，pH2.7作為洗脫液,，洗脫結(jié)合的抗體。某些抗體和Protein G的結(jié)合能力很強,，在pH2.7時洗脫效果不太理想,，可以使用50mM glycine，pH1.9作為洗脫液,。分管收集洗脫下的抗體,，根據(jù)蛋白濃度或后續(xù)的檢測效果確定洗脫峰在哪幾個收集管中。

c. 純化柱的再生：

(a) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌純化柱,，使純化柱達到中性的pH,。

(b) 用TBS來保存再生的純化柱。