目錄:北京蘭博利德商貿(mào)有限公司>>蛋白研究>>蛋白純化>> P0231-25mlProtein A-agarose
| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應用領域 | 食品/農(nóng)產(chǎn)品,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥 |
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Protein A-agarose
貨號：P0231
儲存條件：4℃保存,，有效期一年。請勿冷凍,。
產(chǎn)品描述
Protein A Agarose 主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP),，也可以用于抗體的純化。
Protein A是一種發(fā)現(xiàn)于jin黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細胞壁表面蛋白,，分子量為42kDa,；適當重組改造的Protein A、G與瓊脂糖凝膠(agarose)以一定的方式結合,，可用于免疫沉淀或抗體的純化,。Protein A Agarose適合于免疫沉淀human IgG1、IgG2、IgG4,，mouse IgG2a,、IgG2b及rabbit IgG等。
本品中的重組Protein A可與多數(shù)哺乳動物IgG的Fc端特異性結合,，分子量為14kDa,。該重細Protein A經(jīng)過基因工程技術的改造，使其成為耐堿結構域,，從而實現(xiàn)Protein A的耐堿特性,，并僅保留了與IgG Fc端結合相關的氨基酸序列，去除了結合位點以外可能導致非特異性結合的序列,，從而可以有效減少非特異性結合,。
本品中的Protein A共價連到大孔徑瓊脂糖上。每ml Protein A agarose beads (沉淀物)可以結合超過60mg human IgG,。本品中agarose beads的平均直徑為45-165um,，抗體純化時的推薦線性流速為，400cm/h,，耐壓指數(shù)最高為0.5MPa,。工作pH值范圍為3-12。
本產(chǎn)品配制在可以直接用于免疫沉淀和抗體純化的適當溶液中,，每ml中共含有0.25ml agarose beads (沉淀物),。如果用于常規(guī)的免疫沉淀，每ml本產(chǎn)品(沉淀和溶液為1:3的混合物)可以免疫沉淀50次,。
注意事項
1.請勿冷凍保存本產(chǎn)品,。
2.Protein A Agarose使用前一定要充分重懸，即充分顛倒若干次使混合均勻,。
3.本產(chǎn)品含有微量的防腐劑,，不會影響常規(guī)的免疫沉淀和抗體純化。但如果后續(xù)涉及酶活性測定,，使用本產(chǎn)品前宜先用TBS等適當溶液洗滌Protein A agarose beads三次,，以充分消除防腐劑可能產(chǎn)生的干擾。
4.從蛋白樣品收集開始,，所有步驟中蛋白樣品都必須在4度或冰上操作,。
5.本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療,，不得用于食品或藥品,，不得存放于普通住宅內(nèi)。
6.為了您的安全和健康,，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明:
1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP):
a. 蛋白樣品的準備:
(a) 對于10cm細胞培養(yǎng)皿中的貼壁細胞,，吸除細胞培養(yǎng)液,，PBS洗滌一次,，然后加入500ul至2ml細胞裂解液裂解細胞?？墒褂肔ABLEAD生產(chǎn)的Westen及IP細胞裂解液（Cat：W0013）或各種RIPA裂解液（Cat：R1090/R1091）等進行細胞的裂解,。
(b) 對于組織樣品參考貼壁細胞使用裂解液的比例進行裂解。
(c) 對于懸浮細胞,，離心收集細胞后,，PBS洗滌一次，然后參考貼壁細胞的裂解方法進行裂解,。
注:詳細的裂解方法參考不同裂解液的詳細使用方法,。對于不同的培養(yǎng)器材，參考10厘米培養(yǎng)皿的裂解液的用量進行裂解,。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過高,，可以用裂解液或PBS適當稀釋，如果蛋白樣品濃度過低,，在以后的裂解過程中宜適當減少裂解液的用量,。
b. 去除非特異性結合(可選做):
(a) 取200ul~1ml蛋白樣品，蛋白量約為200ug至1mg,，加入約1ug和免疫沉淀時使用的IgG種屬相同的普通IgG.
和20ul充分重懸的Protein A Agarose,，4°C緩慢搖動30min至2h。
(b) 2500rpm(約1000g)離心5min,，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀,。
注：所謂種屬相同的IgG是指后續(xù)免疫沉淀時用的是小鼠IgG，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG,，如無normal IgG,，可以加入其它不影響后續(xù)檢測的mouse IgG類型的抗體。通過和normal IgG和Protein A Agarose的孵育,，可以充分降低非特異性的結合,，降低背景。
c. 免疫沉淀：
(a) 加入0.2-2ug用于免疫沉淀的一抗,，4℃緩慢搖動過夜,。
(b) 再加入20ul充分重懸的Protein A Agaose，4℃緩慢搖動1-3h(為方便后續(xù)的洗滌操作,，可以把加入充分重懸的Protein A Agatose的量調(diào)整為40ul),。
(c) 2500rpm(約1000g)離心5min，或瞬時高速離心,，小心吸除上清,，注意可留下少量上清但不能吸掉Protein A Aganose。
(d) 用準備蛋白樣品時的裂解液或PBS洗滌沉淀5次，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1ml,。洗滌時離心條件和吸除上清的要求同步驟(c),。
(e) 完成最后一次洗滌后，去除上清,，加入20-40ul 1XSDS-PAGE電泳上樣緩沖液Votex重懸沉淀,，瞬時高速離心把樣品離心至管底。
(f) 100°C或沸水浴處理3-5min,，取部分或全部樣品用于SDS-RAGE電泳,，暫時不用的樣品可以-20°C保存。
2．免疫共沉淀:
參考免疫沉淀的方法進行,，但免疫共沉淀(Co-P)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品,。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍存的蛋白樣品，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳,。
3．抗體純化:
a. 準備工作：
(a) 用0.45um或0.2um孔徑的濾膜過濾所用的溶液,。
(b) 所有的溶液必須用超聲等方法脫氣(degas)。
(c) 選擇適當?shù)募兓?，用適當量的Protein A Agarose裝填純化柱,。也可使用LABLEAD的預裝柱產(chǎn)品（Cat:P0231G）
(d) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌并平衡純化柱，流速可以用恒流泵控制為1ml/min (1ml預裝柱),。如無恒流泵,，也可以完quan依靠重力洗滌并平衡純化柱。
b. 抗體純化：
(a) 把含有待純化的抗體上樣到純化柱,。
(b) 待純化的抗體過柱后,，用10-20倍柱體積的TBS洗滌，以去除未結合和非特異性結合的蛋白,。洗滌是否完quan可以通過測定280nm的吸光度進行確定,。
(c) 洗滌完后，用10ml 50mM glycine,，pH2.7作為洗脫液洗脫結合的抗體,。某些抗體和Protein A的結合能力很強，在pH2.7時洗脫效果不太理想,，可以使用50mM glycine,，pH1.9作為洗脫液。分管收集洗脫下的抗體,，根據(jù)蛋白濃度或后續(xù)的檢測效果確定洗脫峰在哪幾個收集管中,。
c. 純化柱的再生：
(a) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌純化柱，使純化柱達到中性的pH,。
(b) 用TBS來保存再生的純化柱,。
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