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Protein A+G agarose

貨號(hào)：P0233

儲(chǔ)存條件：4℃保存,，有效期一年,。請(qǐng)勿冷凍,。

產(chǎn)品描述

Protein A+G Agarose主要用于免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)或免疫共沉淀(Co-IP)，也可以用于抗體的純化,。

Protein A是一種發(fā)現(xiàn)于jin黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的細(xì)胞壁表面蛋白,，分子量為42kDa；Protein G是C型或G型鏈球菌(Streptococcal bacteria)表達(dá)的免疫球蛋白結(jié)合蛋白,。Protein A和Protein G功能相似,，兩者對(duì)于不同的免疫球蛋白亞類(lèi)的結(jié)合能力有所不同。適當(dāng)重組改造的Protein A,、G與瓊脂糖凝膠(agarose)以一定的方式結(jié)合,，可用于免疫沉淀或抗體的純化。

Protein A+G Agarose適合于免疫沉淀所有Protein A Agarose和Protein G Agarose單獨(dú)可以免疫沉淀的抗體,，包括human IgG1,、IgG2、IgG3,、IgG4,，mouse IgG1、IgG2a,、IgG2b,、IgG3，rat IgG1,、IgG2a,、IgG2b,、IgG2c，rabbit IgG,，rabbit,、goat多克隆抗體。

本產(chǎn)品中的Protein A和Protein G共價(jià)連接到4%的高交聯(lián)度,、高流速瓊脂糖上,，并按1:1比例混合。每mlProtein A+G agarose beads (沉淀物)可以結(jié)合超過(guò)40mg human IgG,。本產(chǎn)品中agarose beads的平均直徑為45-165μm,，抗體純化時(shí)的推薦線(xiàn)性流速為50-300cm/h，耐壓指數(shù)最高為0.1MPa,。  

本Protein A+G Agarose 如果用于常規(guī)的免疫沉淀,，每ml本產(chǎn)品可以免疫沉淀50次。

注意事項(xiàng)

1. 請(qǐng)勿冷凍保存本產(chǎn)品,。

2. Protein A+G Agarose使用前一定要充分重懸,，即充分顛倒若干次使混合均勻。

3. 本產(chǎn)品含有微量的防腐劑,，不會(huì)影響常規(guī)的免疫沉淀和抗體純化,。但如果后續(xù)涉及酶活性測(cè)定，使用本產(chǎn)品前宜先用TBS等適當(dāng)溶液洗滌Protein A+G agarose beads三次,，以充分消除防腐劑可能產(chǎn)生的干擾,。

4. 從蛋白樣品收集開(kāi)始，所有步驟中蛋白樣品都必須在4度或冰上操作,。

5. 本產(chǎn)品僅限于專(zhuān)業(yè)人員的科學(xué)研究用,，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品,，不得存放于普通住宅內(nèi),。

6. 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作,。

使用說(shuō)明:

1. 免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)：

a. 蛋白樣品的準(zhǔn)備：

(a) 對(duì)于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中的貼壁細(xì)胞,，吸除細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗滌一次,，然后加入500ul至2ml細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞,。可以使用LABLEAD生產(chǎn)的Western及IP細(xì)胞裂解液或各種RIPA裂解液等進(jìn)行細(xì)胞的裂解,。

(b) 對(duì)于組織樣品參考貼壁細(xì)胞使用裂解液的比例進(jìn)行裂解,。

(c) 對(duì)于懸浮細(xì)胞，離心收集細(xì)胞后,，PBS洗滌一次,，然后參考貼壁細(xì)胞的裂解方法進(jìn)行裂解。

注：詳細(xì)的裂解方法參考不同裂解液的詳細(xì)使用方法,。對(duì)于不同的培養(yǎng)器材,，參考10cm培養(yǎng)皿的裂解液的用量進(jìn)行裂解。如果裂解獲得的蛋白樣品濃度過(guò)高,，可以用裂解液或PBS適當(dāng)稀釋?zhuān)绻鞍讟悠窛舛冗^(guò)低,，在以后的裂解過(guò)程中宜適當(dāng)減少裂解液的用量。

b. 去除非特異性結(jié)合(可選做)：

(a) 取200ul至1ml蛋白樣品,，蛋白量約為200ug至1mg,，加入約1ug和免疫沉淀時(shí)使用的IgG種屬相同的普通IgG 和20ul充分重懸的Protein A+G Agarose，4oC緩慢搖動(dòng)30min至2h,。

(b) 2500rpm(約1000g)離心5min,，取上清用于后續(xù)的免疫沉淀。

注：所謂種屬相同的IgG是指后續(xù)免疫沉淀時(shí)用的是小鼠IgG,，則在本步驟中可以加入normal mouse IgG,，如無(wú)normal IgG，可以加入其它不影響后續(xù)檢測(cè)的其它mouse IgG類(lèi)型的抗體,。通過(guò)和normal IgG和Protein A+G Agarose的孵育,，可以充分降低非特異性的結(jié)合，降低背景,。

c. 免疫沉淀：

(a) 加入0.2-2ug用于免疫沉淀的一抗,，4oC緩慢搖動(dòng)過(guò)夜。

(b) 再加入20ul充分重懸的Protein A+G Agarose,，4oC緩慢搖動(dòng)1-3h(為方便后續(xù)的洗滌操作,，可以把加入充分重懸的Protein A+G Agarose的量調(diào)整為40ul)。

(c) 2500rpm(約1000g)離心5min,，或瞬時(shí)高速離心,，小心吸除上清，注意寧可留下少量上清也不能吸掉Protein A+G Agarose,。

(d) 用準(zhǔn)備蛋白樣品時(shí)的裂解液或PBS洗滌沉淀5次,，裂解液或PBS的用量每次為0.5-1ml。洗滌時(shí)離心條件和吸除上清的要求同步驟(c),。

(e) 完成最后一次洗滌后,，去除上清，加入20-40ul 1X SDS-PAGE電泳上樣緩沖液Vortex重懸沉淀,，瞬時(shí)高速離心把樣品離心至管底,。

(f) 100oC或沸水浴處理3-5min，取部分或全部樣品用于SDS-PAGE電泳,，暫時(shí)不用的樣品可以-20oC保存,。

2. 免疫共沉淀：

參考免疫沉淀的方法進(jìn)行,，但免疫共沉淀(Co-IP)通常必須使用未經(jīng)凍存的新鮮蛋白樣品。普通的免疫沉淀雖然可以使用凍

存的蛋白樣品,，但也宜用新鮮的蛋白樣品為佳,。

3. 抗體純化：

a. 準(zhǔn)備工作：

(a) 用0.45um或0.2um孔徑的濾膜過(guò)濾所用的溶液。

(b) 所有的溶液必須用超聲等方法脫氣(degas),。

(c) 選擇適當(dāng)?shù)募兓?，用適當(dāng)量的Protein A+G Agarose裝填純化柱。也可使用LABLEAD的預(yù)裝柱產(chǎn)品,。

(d) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌并平衡純化柱,，流速可以用恒流泵控制為1ml/min (1ml預(yù)裝柱)。如無(wú)恒流泵,，也可以wanquan依靠重力洗滌并平衡純化柱,。

b. 抗體純化：

(a) 把含有待純化的抗體上樣到純化柱。

(b) 待純化的抗體過(guò)柱后,，用10-20倍柱體積的TBS洗滌,，以去除未結(jié)合和非特異性結(jié)合的蛋白。洗滌是否wanquan可以通過(guò)測(cè)定280nm的吸光度進(jìn)行確定,。

(c) 洗滌完后,，用10ml 50mM glycine，pH2.7作為洗脫液,，洗脫結(jié)合的抗體,。某些抗體和Protein A+G的結(jié)合能力很強(qiáng)，在pH2.7時(shí)洗脫效果不太理想,，可以使用50mM glycine,，pH1.9作為洗脫液。分管收集洗脫下的抗體,，根據(jù)蛋白濃度或后續(xù)的檢測(cè)效果確定洗脫峰在哪幾個(gè)收集管中,。

c. 純化柱的再生：

(a) 用10-20倍柱體積的TBS洗滌純化柱，使純化柱達(dá)到中性的pH,。 (b) 用TBS來(lái)保存再生的純化柱,。