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MBP-Nanoab-Agarose

產(chǎn)品貨號(hào)：BNA

儲(chǔ)存條件：可在4℃保存1年，或在-80℃長(zhǎng)期保存,，避免反復(fù)凍融,。

產(chǎn)品描述

偶聯(lián)anti-MBP標(biāo)簽納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀MBP融合蛋白,。

產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)

l沒(méi)有普通抗體的輕鏈和重鏈,；

l高親和力：解離常數(shù)達(dá)到pM級(jí)別,；

l高載量：10μl的slurry可以結(jié)合2-4μg MBP蛋白,；

l較短的孵育時(shí)間,，結(jié)合5-30min即可,；

應(yīng)用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）,、酶活性測(cè)定,、質(zhì)譜分析等；

特異性

可以結(jié)合MBP標(biāo)簽融合蛋白,。

產(chǎn)品特性

存儲(chǔ)緩沖液：PBS(含有20%乙醇),。

保存條件：可在4℃保存1年，或在-80℃長(zhǎng)期保存,，避免反復(fù)凍融,。

實(shí)驗(yàn)原理

實(shí)驗(yàn)步驟：

 收集細(xì)胞：

每個(gè)免疫沉淀反應(yīng)大約使用 10⁶-10⁷ 個(gè)表達(dá)綠色熒光蛋白融合蛋白的細(xì)胞，可根據(jù)綠色熒光蛋白融合蛋白表達(dá)量適當(dāng)調(diào)整細(xì)胞數(shù),。吸出培養(yǎng)基,，向培養(yǎng)皿中加入預(yù)冷的1×PBS，漂洗2次,，利用細(xì)胞刮或yi酶消化收集貼壁細(xì)胞,，細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管，500g離心3分鐘并丟棄上清液,。

 細(xì)胞裂解：

1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液重懸細(xì)胞。

2．置于冰上30分鐘,，可每10分鐘充分吹打一次,。
3．4℃，20,000g離心15分鐘,，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的預(yù)冷管中,，丟棄沉淀。注意：此時(shí)細(xì)胞裂解產(chǎn)物可長(zhǎng)期保存于-80℃,。  

  平衡珠子：

4．振蕩充分混勻MBP-Nanoab-Agarose,， 吸取20μl該產(chǎn)品到500 μl預(yù)冷的裂解緩沖液中，4℃,，2,500g離心2分鐘,，丟棄上清液。（此步驟可選）  

  結(jié)合蛋白

5．將平衡好的MBP-Nanoab-Agarose加入到細(xì)胞裂解產(chǎn)物中（如果未做第4步,，可在細(xì)胞裂解產(chǎn)物中直接加入20μl該產(chǎn)品）,，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合5-30min。如果需要,，留存50μl的裂解產(chǎn)物進(jìn)行免疫印跡分析,。
6．4℃，2,500g離心2分鐘,，丟棄上清液,。如果需要,，留存50μl上清液進(jìn)行免疫印跡分析。

  清洗珠子：

7．用500μl預(yù)冷的裂解緩沖液中重懸6中的MBP-Nanoab-Agarose,，4℃,，2,500g條件下離心2分鐘，丟棄上清液并重復(fù)洗滌2次,。

  洗脫蛋白：

方法一：
8．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸MBP-Nanoab-Agarose,。
95℃，加熱10min,，2,500g離心2分鐘收集上清,，收集的產(chǎn)物可進(jìn)行SDS-PAGE及免疫印跡分析。

方法二：
9．替代步驟8的可選步驟：加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結(jié)合的蛋白,，孵育時(shí)間30秒,，期間不斷混勻，2,500g離心2分鐘收集上清,，為了中和酸性的gan氨酸,，需加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為了提高洗脫效率可以重復(fù)這一步,。

可選方案

方案一：
如需進(jìn)行MBP融合酶的活性檢測(cè)，無(wú)需洗脫,，可以直接檢測(cè),。

方案二：
如需進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實(shí)驗(yàn)，主要用于含有MBP融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實(shí)驗(yàn),。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細(xì)胞固定,，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀,， 聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化以及DNA的鑒定。其中前期細(xì)胞固定,，染色質(zhì)斷裂不變,；然后接著直接進(jìn)入說(shuō)明書(shū)的第5步，加入細(xì)胞裂解產(chǎn)物后,，DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物結(jié)合到MBP-Nanoab-Agarose上,；
進(jìn)入第6和7步，分離得到復(fù)合物,；進(jìn)入第10步,，得到洗脫的復(fù)合物；后期交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實(shí)驗(yàn),。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實(shí)驗(yàn)步驟同上,。

方案三：
MBP-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測(cè)和驗(yàn)證蛋白質(zhì)之間的相互作用， 也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法,，得到洗脫的復(fù)合物后，然后進(jìn)行SDS–PAGE分析,，用考馬斯亮藍(lán)或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白,。