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| 供貨周期 | 現(xiàn)貨 | 應用領(lǐng)域 | 食品/農(nóng)產(chǎn)品,化工,生物產(chǎn)業(yè),農(nóng)林牧漁,制藥/生物制藥 |
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MBP-Nanoab-Agarose
產(chǎn)品貨號：BNA
儲存條件：可在4℃保存1年，或在-80℃長期保存，避免反復凍融,。
產(chǎn)品描述
偶聯(lián)anti-MBP標簽納米抗體的瓊脂糖珠子用于免疫沉淀MBP融合蛋白。
產(chǎn)品優(yōu)勢
l沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；
l高親和力：解離常數(shù)達到pM級別,；
l高載量：10μl的slurry可以結(jié)合2-4μg MBP蛋白；
l較短的孵育時間,，結(jié)合5-30min即可,；
應用范圍
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）,、酶活性測定,、質(zhì)譜分析等；
特異性
可以結(jié)合MBP標簽融合蛋白,。
產(chǎn)品特性
存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇),。
保存條件：可在4℃保存1年，或在-80℃長期保存,，避免反復凍融,。
實驗原理
實驗步驟：
收集細胞：
每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 個表達綠色熒光蛋白融合蛋白的細胞，可根據(jù)綠色熒光蛋白融合蛋白表達量適當調(diào)整細胞數(shù),。吸出培養(yǎng)基,，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS，漂洗2次,，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞,，細胞轉(zhuǎn)移到離心管，500g離心3分鐘并丟棄上清液,。
細胞裂解：
1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞。
2．置于冰上30分鐘,，可每10分鐘充分吹打一次,。
3．4℃,，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預冷管中,，丟棄沉淀,。注意：此時細胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。
平衡珠子：
4．振蕩充分混勻MBP-Nanoab-Agarose,， 吸取20μl該產(chǎn)品到500 μl預冷的裂解緩沖液中,，4℃，2,500g離心2分鐘,，丟棄上清液,。（此步驟可選）
結(jié)合蛋白
5．將平衡好的MBP-Nanoab-Agarose加入到細胞裂解產(chǎn)物中（如果未做第4步，可在細胞裂解產(chǎn)物中直接加入20μl該產(chǎn)品）,，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結(jié)合5-30min,。如果需要，留存50μl的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析,。
6．4℃,，2,500g離心2分鐘，丟棄上清液,。如果需要,，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。
清洗珠子：
7．用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸6中的MBP-Nanoab-Agarose,，4℃,，2,500g條件下離心2分鐘，丟棄上清液并重復洗滌2次,。
洗脫蛋白：
方法一：
8．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸MBP-Nanoab-Agarose,。
95℃，加熱10min,，2,500g離心2分鐘收集上清,，收集的產(chǎn)物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
9．替代步驟8的可選步驟：加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結(jié)合的蛋白,，孵育時間30秒,，期間不斷混勻，2,500g離心2分鐘收集上清,，為了中和酸性的gan氨酸,，需加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步,。
可選方案
方案一：
如需進行MBP融合酶的活性檢測,，無需洗脫，可以直接檢測,。
方案二：
如需進行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗,，主要用于含有MBP融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗,。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂,，染色質(zhì)免疫沉淀,， 聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化以及DNA的鑒定,。其中前期細胞固定,，染色質(zhì)斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第5步,，加入細胞裂解產(chǎn)物后,，DNA-蛋白質(zhì)復合物結(jié)合到MBP-Nanoab-Agarose上；
進入第6和7步,，分離得到復合物,；進入第10步，得到洗脫的復合物,；后期交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上,。
方案三：
MBP-Nanoab-Agarose 不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用， 也可以結(jié)合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法,，得到洗脫的復合物后，然后進行SDS–PAGE分析,，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶，用質(zhì)譜技術(shù)鑒定未知蛋白,。
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