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HA-Nanoab-Magnetic Beads

貨號：HNM-25-1000

儲存條件：可在4℃保存1年(確保完quan密封),，避免離心，干燥和凍融,。

產(chǎn)品描述

偶聯(lián)anti-HA-tag納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀HA-tag (YPYDVPDYA)融合蛋白,。

產(chǎn)品優(yōu)勢

沒有普通抗體的輕鏈和重鏈，背景干凈,；

即用型,，節(jié)約時間；

高親和力,，高載量,。

應用范圍

可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）/RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）,、酶活性測定,、質(zhì)譜分析等。

特異性

特異性結合位于融合蛋白N-端,、C-端及內(nèi)部的HA-tag,。

產(chǎn)品特性

存儲緩沖液：PBS(含有20%乙醇)。

保存條件：可在4℃保存1年(確保完quan密封),，避免離心,，干燥和凍融。

實驗原理

實驗步驟：

收集細胞
每個免疫沉淀反應大約使用 10⁶-10⁷ 個表達HA-tag融合蛋白的細胞,，可根據(jù)HA-tag融合蛋白表達量適當調(diào)整細胞數(shù),。吸出培養(yǎng)基，向培養(yǎng)皿中加入預冷的1×PBS,，漂洗2次,，利用細胞刮或yi酶消化收集貼壁細胞，細胞轉(zhuǎn)移到離心管,，500g離心3分鐘并丟棄上清液,。

植物組織裂解處理：

取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨,，盡可能充分研磨破壞其細胞壁。加入500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解,，為了提高裂解效率,，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min,，裂解完成后 12000 rpm，離心 30min,，吸取上清 置新的離心管中,，棄去沉淀。

細胞裂解
1．在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑,，用500μl預冷的裂解緩沖液重懸細胞,。

2．置于冰上30分鐘，可每10分鐘充分吹打一次,。

3．4℃,，20,000g離心15分鐘，將裂解產(chǎn)物（上清）轉(zhuǎn)移到一個新的預冷管中,，丟棄沉淀,。注意：此時細胞裂解產(chǎn)物可長期保存于-80℃。

結合蛋白
4．將40μl平衡好的HA-Nanoab-Magnetic Beads加入到細胞裂解產(chǎn)物中（可在細胞裂解產(chǎn)物中直接加入40μl該產(chǎn)品）,，于4℃旋轉(zhuǎn)混合結合1小時,。根據(jù)實驗需要可調(diào)整結合時間。如果需要,，留存50μl的裂解產(chǎn)物進行免疫印跡分析,。
5．在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液,。如果需要,，留存50μl上清液進行免疫印跡分析。

清洗珠子
6．用500μl預冷的裂解緩沖液中重懸5中的HA-Nanoab-Magnetic Beads,，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),，丟棄上清液并重復清洗3次。盡量減少清洗時間,。

洗脫蛋白
方法一：
7．加入20μl 2×SDS-sample buffer重懸HA-Nanoab-Magnetic Beads,。95℃，加熱10min充分變性,，在磁力架上進行分離,，收集的產(chǎn)物可進行SDS-PAGE及免疫印跡分析。
方法二：
8．加入50μl 0.2 M pH2.5的gan氨酸洗脫結合的蛋白,，孵育時間30秒,，期間不斷混勻，在磁力架上進行分離并收集上清,，立即加入5μl 1.0 M Tris（pH10.4）以中和酸性的gan氨酸,。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。

方法三：

9. 加入40µM HA-peptide進行洗脫,。

可選實驗方案
方案一：
如需進行HA融合酶的活性檢測,，無需洗脫,，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）實驗,，主要用于含有HA融合蛋白的蛋白質(zhì)/DNA相互作用的實驗,。染色質(zhì)免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質(zhì)斷裂,，染色質(zhì)免疫沉淀,，聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn)，DNA的純化以及DNA的鑒定,。其中前期細胞固定,，染色質(zhì)斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第4步,，加入細胞裂解產(chǎn)物后,，DNA-蛋白質(zhì)復合物結合到HA-Nanoab-Magnetic Beads上；
進入第5和6步,，分離得到復合物,；進入第8步，得到洗脫的復合物,；后期交聯(lián)反應的逆轉(zhuǎn),，DNA的純化及DNA的鑒定等同于普通的ChIP實驗。RNA結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上,。
方案三：
HA-Nanoab-Magnetic Beads不僅可以用于在體內(nèi)外檢測和驗證蛋白質(zhì)之間的相互作用,，也可以結合質(zhì)譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白。其操作步驟同免疫沉淀法,，得到洗脫的復合物后,，然后進行SDS–PAGE分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶,，用質(zhì)譜技術鑒定未知蛋白。