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| 供貨周期 | 現貨 | 應用領域 | 食品/農產品,化工,生物產業(yè),農林牧漁,制藥/生物制藥 |
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GFP-Nanoab-Magnetic Beads貨號：GNM-25-1000
儲存條件：可在 4℃保存半年,，避免離心,，干燥,，長時間保存可凍存。
產品描述：
偶聯 anti-GFP 納米抗體的磁性納米微球用于免疫沉淀 GFP 融合蛋白。
產品優(yōu)勢：
沒有普通抗體的輕鏈和重鏈；
高親和力：解離常數達到 pM 級別,；
高載量：20μl 的 slurry 可以結合 8-10μg GFP 蛋白；
較短的孵育時間,，結合 5-30 min 即可,；
應用范圍：
可用于免疫沉淀（IP）/免疫共沉淀（CoIP）、染色質免疫沉淀（ChIP）/RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）,、酶活性測定,、質譜分析等；
特異性
可以結合 GFP,、EGFP,、YFP 和 EYFP 等。
產品特性：
保存條件：可在 4℃保存半年,，避免離心,，干燥，長時間保存可凍存,。
存儲緩沖液：PBS(含有 20%乙醇)。
實驗步驟：
收集細胞：
每個免疫沉淀反應大約使用 106-107 的哺乳動物細胞（約一個 10 cm培養(yǎng)皿）表達綠色熒光蛋白融合蛋白,。吸出生長培養(yǎng)基,、向培養(yǎng)皿中加入 2ml預冷的 PBS 洗滌細胞 2 次，利用細胞刮或yi酶消化的方法收集貼壁細胞,，細胞轉移到離心管,，500 g離心 3 分鐘并丟棄上清液。
植物組織裂解處理：
取適量植物組織樣本（葉片等）放置于冷凍液氮中,，之后將冷凍后得植物組織樣本放于研缽進行研磨,，盡 可能充分研磨破壞其細胞壁。加入 500-1000ul RIPA 裂解液（已加蛋白酶抑制劑 PMSF 等）進行裂解,，為了提高裂解效率,，加入 200ul 玻璃粉充分震蕩 30min，裂解完成后 12000 rpm,，離心 30min,，吸取上清 置新的離心管中，棄去沉淀。
細胞裂解：
1．用500μl 預冷的裂解緩沖液重懸細胞,，在裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF（自備）,。對于核/染色質蛋白可使用 RIPA 裂解液中加入1 mg/ml DNase, 2.5 mM MgCl2，蛋白酶抑制劑與 1 mM PMSF（自備）,。
2．把離心管放置在冰上 30 分鐘,，可以每 10 分鐘充分吹打一次。
3．細胞裂解產物在 4℃,，20,000 g 條件下離心 15 分鐘,，轉移裂解產物到一個新的預冷管中，丟棄沉淀,。注意：此時細胞裂解產物可以放在-80℃進行長期儲存,。
平衡珠子：
4．振蕩混勻 GFP-Nanoab-Magnetic Beads，吸取 40μl slurry 到 500 μl 預冷的裂解緩沖液中,，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),，丟棄上清液。（此步驟可選）
結合蛋白
5．將細胞裂解產物加入到平衡的 GFP-Nanoab -Magnetic Beads 中（如果未做第 4 步,，可在細胞裂解產物中直接加入40μl slurry）,，在 4 ℃冷柜中的旋轉混合儀上結合 30-60 min。如果需要,，保存 50 μl 的裂解產物進行免疫印跡分析,。
6. 在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài)，丟棄上清液,。如果需要,，保存 50 μl 上清液進行免疫印跡分析。
清洗珠子：
7. 用 500 μl 預冷的裂解緩沖液中重懸 GFP-Nanoab -Magnetic Beads,，在磁力架上分離磁珠直到上清變成清亮的狀態(tài),，丟棄上清液并重復洗滌 2 次。（可選：在第二次洗滌的步驟中增加鹽濃度到 500 mM）,。
洗脫蛋白
方法一：
加入 20μl 2X SDS-sample buffer 重懸 GFP-Nanoab -Magnetic Beads,。
在 95℃，10 min 條件下,，加熱 GFP-Nanoab -Magnetic Beads,，把免疫沉淀復合物從珠子上游離出來。GFP-Nanoab -Magnetic Beads 可在磁力架上進行分離,，收集的產物可以進行 SDS–PAGE 分析,。
方法二：
替代步驟 8 和 9 的可選步驟：加入 50μl 0.2 M pH2.5 的gan氨酸洗脫結合的蛋白，建議孵育時間 30 秒,，并不斷混勻,，隨后用磁力架進行分離,，轉移上清液到新管中，為了中和酸性的gan氨酸,，需添加 5μl 1.0 M Tris（pH10.4）,。注意：為了提高洗脫效率可以重復這一步。
可選方案
方案一：
如需進行 GFP 融合酶的活性檢測,，無需洗脫,，可以直接檢測。
方案二：
如需進行染色質免疫沉淀（ChIP） 實驗,，主要用于含有 GFP 融合蛋白的蛋白質/DNA 相互作用的實驗,。染色質免疫沉淀一般包括細胞固定，染色質斷裂,，染色質免疫沉淀,，交聯反應的逆轉，DNA 的純化以及 DNA 的鑒定,。其中前期細胞固定,，染色質斷裂不變；然后接著直接進入說明書的第 5 步,，加入細胞裂解產物后,，DNA-蛋白質復合物結合到 GFP-Nanoab -Magnetic Beads上；進入第 6 和 7 步,，分離得到復合物,；進入第 10 步，得到洗脫的復合物,；后期交聯反應的逆轉,，DNA 的純化及 DNA 的鑒定等同于普通的 ChIP 實驗。RNA 結合蛋白免疫沉淀（RIP）實驗步驟同上,。
方案三：
GFP-Nanoab -Magnetic Beads 不僅可以用于在體內外檢測和驗證蛋白質之間的相互作用，也可以結合質譜分析篩選與已知蛋白相互作用的未知蛋白,。其操作步驟同免疫沉淀法，得到洗脫的復合物后,，然后進行 SDS–PAGE 分析，用考馬斯亮藍或者銀染的方法染色后,，切下未知蛋白的條帶,，用質譜技術鑒定未知蛋白。
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