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MBP 標簽親和填料 （麥芽糖結合蛋白）

產(chǎn)品貨號：M1050

儲存條件：2-8 °C

產(chǎn)品簡介

Dextrin Beads 6FF 是一種純化帶有麥芽糖結合蛋白(MBP）標簽蛋白的親和層析介質，具體性能見表1,。MBP可促進連接蛋白的正確折疊,，增加在細菌中過量表達的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白,。Dextrin Beads 6FF可以一步純化MBP融合蛋白,，結合的融合蛋白可以用10 mM麥芽糖進行溫和洗脫，保護了標簽蛋白的活性,。如果要去除MBP融合部分可用位點特異性蛋白酶切除,。

表 1 Dextrin Beads 6FF 產(chǎn)品性能

純化流程

1. 緩沖液的準備

所用水和緩沖液在使用之前建議用0.22 um或0.45 um濾膜過濾。

平衡/洗雜液: 20 mM Tris-HCI,，200 mM NaCl,，1 mM EDTA，pH7.4

洗脫液: 20 mM Tris-HCl,，1 mM EDTA,，10 mM麥芽糖，pH7.4

注意: 平衡液和洗脫液中可加入1 mM DTT或10 mM β-疏基乙醇

2. 樣品準備

樣品在上樣前建議離心或用0.22um或0.45um濾膜過濾,，減少雜質,，提高蛋白純化效率和防止堵塞柱子。

3 Dextrin Beads 6FF裝填

3.1重力柱的裝填

1）取合適規(guī)格的重力層析柱,，裝入下墊片,，加入適量純水潤洗柱管和墊片，關閉下出口,。

2）將Dextrin Beads 6FF混合均勻,，用槍頭吸取適量漿液加入至重力柱中(介質實際體積占懸液的一半)，打開下出口流干保護液,。

3）加入適量純水沖洗介質,，待柱管中液體重力流干后，關閉下出口,。

4）裝入潤洗后的上墊片,，確保墊片與填料之前沒有空隙，且保持水平,。

5）裝填好的重力柱可以直接加入平衡液進行平衡,，暫不使用時則加入保護液，2-8℃保存,。

3.2中壓層析柱的裝填

Dextrin Beads 6FF被廣泛應用于工業(yè)純化,，因此，涉及到各種中壓色譜層析柱的填裝,，下面介紹填裝層析柱的方法,。裝柱前根據(jù)層析柱直徑計算柱子底面積,，根據(jù)所需裝柱高度計算所需介質體積，公式如下:

V = 1.15πr²h  (V：所需介質體積ml,；1.15：壓縮系數(shù),；r：柱管半徑cm；h：裝填高度cm）

注意：所取懸液體積應為介質體積的兩倍,，因為介質體積只占懸液總體積的一半,，另一半為保護液。

1） 用去離子水沖洗層析柱底篩板與接頭,，確保柱底篩板上無氣泡,，關閉柱底出口，并在柱底部留1-2 cm的去離子水,。

2） 將介質懸浮起來,，小心的將漿液連續(xù)地倒入層析柱中。用玻璃棒沿著柱壁倒入漿液可減少氣泡的產(chǎn)生,。

3） 如果使用儲液器,，應立即在層析柱和儲液器中加滿水，將進樣分配器放置于漿液表面,，連接至泵上,，避免在分配器或進樣管中產(chǎn)生氣泡。

4） 打開層析柱底部出口,，開啟泵,，使其在設定的流速下進行。最初應讓緩沖液緩慢流過層析柱,，然后緩慢增加至最終流速,，這樣可避免液壓對所形成柱床的沖擊，也可以避免柱床形成的不均勻,。如果達不到推薦的壓力或流速,，可以用所使用泵的最大流速,，這樣也可以得到一個很好的裝填效果,。（注意：在隨后的色譜程序中，不要超過最大裝柱流速的75%）當柱床高度穩(wěn)定后,，在最后的裝柱流速下至少再上3倍柱床體積的去離子水,。標上柱床高度。

5） 關閉泵,，關閉層析柱出口,。

6） 如果使用儲液器，去除儲液器,，將分配器置于層析柱中,。

7） 將分配器推向柱子至標記的柱床高度處,。允許裝柱液進入分配器，鎖緊分配器接頭,。

8） 將裝填好的層析柱連接至泵或色譜系統(tǒng)中,，開始平衡。如果需要可以重新調整分配器,。

4. 樣品純化流程

4.1孵育法純化

1） 根據(jù)純化樣品量,，取適量Dextrin Beads 6FF加入離心管中，1000rpm離心1 min,吸棄上清,；也可加入重力柱中,，流干保護液。

2） 向離心管中加入5倍介質體積的平衡液清洗介質,，1000rpm離心1 min,吸棄上清,；如使用重力柱，則直接在重力柱中清洗,，直接重力流干平衡液,；重復兩次以上。

3） 加入樣品,，封閉離心管或重力柱管,，4°C振蕩孵育2-4h或者37°C孵育30 min-2h。

4） 孵育結束后,，1000 rpm離心1 min,吸棄上清,，或過濾收集介質，上清保留作為流穿,，用于電泳鑒定,。

5） 用5倍介質體積的洗雜液清洗介質，1000 rpm離心1 min或重力柱管過濾,，去除上清（注意不要吸到介質）,，重復3-5次，中間建議更換新離心管,。

6） 加入3-5倍柱體積的洗脫液進行洗脫,，室溫孵育10-15 min, 1000 rpm離心1 min或重力柱管收集洗脫液，可重復2-3次,。

4.2重力柱法純化

1） 將裝填好的Dextrin Beads 6FF重力柱用5倍柱體積平衡液進行平衡,，使填料處于與目的蛋白相同的緩沖液體系下，重復2-3次,。

2） 將樣品加到平衡好的重力柱中,，樣品保留時間至少2 min,保證樣品和介質充分接觸，收集流出液,，可

以反復上樣增加結合效率,。

3） 用10-15倍柱體積的洗雜液進行洗雜,，去除非特異性吸附的雜蛋白，收集洗雜液,。

4） 使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫,，分段收集，每一個柱體積收集一管,，分別檢測,，既可以保證所有結合的目的蛋白被洗脫，又可以得 到高純度和高濃度的蛋白,。

4.3中壓層析柱法純化

Dextrin Beads 6FF裝填好后,，可以用各種常規(guī)的中低壓色譜系統(tǒng)。

1） 將泵管道中注滿去離子水,。去掉上塞子,，將層析柱連接至色譜系統(tǒng)中，打開下出口,，將預裝柱接到色譜系統(tǒng)中,，并旋緊。

2） 用3-5倍柱體積的去離子水沖洗出儲存緩沖液,。

3） 使用至少5倍柱床體積的平衡液平衡色譜柱,。

4） 利用泵或樣品環(huán)上樣。

注:樣品的粘度增加使得即使上樣體積很少,，也會導致層析柱很大的反壓,。上樣量不要超過柱子的結合能力。大量的樣品體積也可能造成很大的反壓,，使得進樣器更難使用,。

5） 用洗雜液沖洗柱子，直到紫外吸收達到一個穩(wěn)定的基線（一般至少10-15個柱體積）,。

6） 使用5-10倍柱體積的洗脫液洗脫,，收集洗脫液，即目的蛋白組分,。

上述步驟洗脫結束后,，用平衡液沖洗3倍柱體積，然后用純水沖洗5倍柱體積,，再用保護液沖洗2個柱體積,，然后將介質置于2-8°C保存。

5. SDS-PAGE 檢測

將使用純化產(chǎn)品得到的樣品（包括流出組分,、洗雜組分和洗脫組分）以及原始樣品使用SDS-PAGE檢測純化效果。

6. 填料清洗

Dextrin Beads 6FF純化產(chǎn)品可以重復使用而無需再生,，但隨著非特異性結合的蛋白的增多和蛋白的聚集,，往往造成流速和結合載量都下降,，這時可按照下面方法對填料進行清洗。

1）3倍柱體積的去離子水;

2）3倍柱體積的0.1% SDS或0.1 M NaOH溶液;

3）3倍柱體積去離子水,，20%乙醇2-8℃保存,。