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細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒

產(chǎn)品貨號(hào)：C1002-50T

存儲(chǔ)條件：-20°C避光，有效期24個(gè)月

產(chǎn)品說明：

細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(Cell Cycle and Apoptosis Analysis Kit)是一種采用經(jīng)典的碘化丙啶染色(Propidium Iodide staining)方法進(jìn)行細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡分析,。

碘化丙啶(Propidium Iodide，簡稱PI)是一種雙鏈DNA的熒光染料,。碘化丙啶和雙鏈DNA結(jié)合后可以產(chǎn)生熒光,，并且熒光強(qiáng)度和雙鏈DNA的含量成正比。細(xì)胞內(nèi)的DNA被碘化丙啶染色后,，可以用流式細(xì)胞儀對細(xì)胞進(jìn)行DNA含量測定,，然后根據(jù)DNA含量的分布情況，可以進(jìn)行細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡分析,。

碘化丙啶染色后,，假設(shè)G0/G1期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1，那么含有雙份基因組DNA的G2/M期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度的理論值為2,，正在進(jìn)行DNA復(fù)制的S期細(xì)胞的熒光強(qiáng)度為1-2之間,。凋亡細(xì)胞由于細(xì)胞核發(fā)生濃縮以及發(fā)生DNA片段化(DNA fragmentation)導(dǎo)致部分基因組DNA片段在染色過程中丟失，因此凋亡細(xì)胞碘化丙啶染色后呈現(xiàn)明顯的弱染,，即熒光強(qiáng)度小于1,，在流式檢測的熒光圖上出現(xiàn)所謂的sub-G1峰，即凋亡細(xì)胞峰,。

細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),，由于胞漿和染色質(zhì)濃縮、核碎裂,，產(chǎn)生凋亡小體,，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生變化。在細(xì)胞凋亡的早期,，細(xì)胞對前向角光散射的能力顯著降低,，對側(cè)向光散射的能力增加或沒有變化。在細(xì)胞凋亡的晚期,，前向和側(cè)向光散射的信號(hào)均降低,。因此可通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞光散射的變化觀察細(xì)胞凋亡情況。

本試劑盒通常應(yīng)用于培養(yǎng)的貼壁或懸浮細(xì)胞的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測,。如果用于組織的細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡檢測,，則必須把組織消化成單細(xì)胞狀態(tài)，才可以進(jìn)行檢測,。

本試劑盒足夠檢測50個(gè)樣品,，每個(gè)樣品的細(xì)胞數(shù)量可以為10-100萬。

注意事項(xiàng)：

1）本試劑盒需要使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測,。需自備PBS和70%乙醇,。

2）細(xì)胞處理需輕柔，盡量避免人為的損傷細(xì)胞。

3）為防止不同批次細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)時(shí)所處周期不同導(dǎo)致重復(fù)性差,，可以在實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行細(xì)胞的同步化處理,。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞應(yīng)處于對數(shù)生長期，貼壁細(xì)胞一般在50～80%匯合度時(shí)收集為宜,。

4）400目篩網(wǎng)過濾是用來將粘在一起的細(xì)胞團(tuán)濾掉,，留下單細(xì)胞，否則會(huì)出現(xiàn)人為的多倍體干擾,。如果沒有條件過濾,，請?jiān)谌旧皩⒓?xì)胞輕彈以分散，再進(jìn)行染色,。

5）熒光染料均存在淬滅問題,，保存和使用過程中請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅,。

6）碘化丙啶對人體有刺激性，操作碘化丙啶時(shí),，應(yīng)注意防護(hù),，保護(hù)眼睛、避免吸入,。

7）為了您的安全和健康,，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

產(chǎn)品組成：

使用方法：

1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備：細(xì)胞數(shù)量控制在1×105~1 × 106個(gè),。

a）貼壁細(xì)胞：小心吸除細(xì)胞培養(yǎng)液,，用胰酶消化細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液,。1000 g離心5 min,，沉淀細(xì)胞，棄上清,，用1 mL預(yù)冷的PBS潤洗細(xì)胞一次,，離心收集細(xì)胞。

b）懸浮細(xì)胞：1000 g離心5 min,，沉淀細(xì)胞,，小心吸除上清。加入1 mL預(yù)冷的PBS,，重懸細(xì)胞,，再次離心收集細(xì)胞。

c）組織細(xì)胞：將組織塊用剪刀剪成盡量小的小塊后,，用0.25%的胰酶消化0.5-1 h,，經(jīng)過200-400目篩網(wǎng)過濾得到單細(xì)胞懸液。1000 g離心5 min，沉淀細(xì)胞,。加入約1 mL預(yù)冷的PBS,，重懸細(xì)胞，再次離心沉淀細(xì)胞,。如組織難以消化,，可加入適量膠原酶。

2. 細(xì)胞固定：

細(xì)胞沉淀用1 mL預(yù)冷的70%乙醇輕輕混勻,，4℃固定2 h以上或者過夜,。然后1000 g左右離心5 min沉淀細(xì)胞后，小心吸除上清,，可以殘留約50微升左右的70%乙醇,，以避免吸走細(xì)胞。

加入1 mL預(yù)冷的PBS重懸,。然后再次1000g離心5 min沉淀細(xì)胞,。小心吸除上清，可以殘留約50微升左右的PBS,，以避免吸走細(xì)胞,。輕輕彈擊離心管底以適當(dāng)分散細(xì)胞，避免細(xì)胞成團(tuán),。

3. 碘化丙啶染色液的配制：

對于1個(gè)樣品,，在0.5 mL染色緩沖液中加入25uL 碘化丙啶儲(chǔ)液和10uL RNase A溶液，混勻待用,。其它數(shù)量的樣品參考下表,，根據(jù)待檢測樣品的數(shù)量配制適量的碘化丙啶染色液：

注：配制好的碘化丙啶染色液短時(shí)間內(nèi)可以4℃保存，宜當(dāng)日使用,。

4. 染色：

每管細(xì)胞樣品中加入0.5毫升碘化丙啶染色液,，輕輕混勻重懸細(xì)胞沉淀，37℃避光孵育30分鐘,，就可以進(jìn)行流式檢測,，流式檢測最hao在5h內(nèi)完成。

5. 流式檢測和分析：

用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長488nm波長處檢測紅色熒光,，同時(shí)檢測光散射情況,。采用適當(dāng)分析軟件進(jìn)行細(xì)胞DNA含量分析和光散射分析。