PCR檢測(cè)步驟

1.將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接,，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品,，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,；

2.待測(cè)樣本與步驟1所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù),，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值,，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果。

其中步驟1為：將參照基因與待測(cè)目的基因片段等比例連接,，克隆到同一個(gè)質(zhì)粒載體上,，構(gòu)建一種可同時(shí)用于參照基因以及待測(cè)目的基因擴(kuò)增檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)品，并將所得標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度稀釋后同時(shí)用于繪制參照基因以及待測(cè)目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

其中所述參照基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)參照基因,，較佳地管家基因，優(yōu)選地為RPPH1的擴(kuò)增區(qū)域,，其中所述質(zhì)粒載體為本領(lǐng)域常規(guī)質(zhì)粒載體,，較佳地為PCR克隆載體，優(yōu)選地為T(mén)A cloning載體,，所述TA cloning載體較佳地為pMD18-T載體,。其中所述標(biāo)準(zhǔn)品的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:6所示,。所述的等比例較佳地為1：1。由于標(biāo)準(zhǔn)品中待測(cè)目的基因與參照基因的比例為1:1,，解決了目前相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線法應(yīng)用中目的基因與參照基因的濃度比例關(guān)系難以控制的問(wèn)題,，提高HER2基因擴(kuò)增檢測(cè)的可靠性。

步驟2為：待測(cè)樣本與步驟(1)所述標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)同步進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增后,，目的基因與參照基因按照各自的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各自的拷貝數(shù),，計(jì)算待測(cè)樣本的目的基因與參照基因拷貝數(shù)比值，即得目的基因的拷貝數(shù)相對(duì)定量檢測(cè)結(jié)果,。

其中所述待測(cè)目的基因?yàn)楸绢I(lǐng)域常規(guī)待測(cè)目的基因,，較佳地為腫瘤或者疾病的特異性基因，更佳地為HER2基因的擴(kuò)增區(qū)域,，所述熒光定量PCR擴(kuò)增為本領(lǐng)域常規(guī)熒光定量PCR擴(kuò)增方法,，所述熒光定量PCR擴(kuò)增方法較佳地為多通道熒光定量PCR擴(kuò)增，更佳地為雙通道熒光定量PCR擴(kuò)增,。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法,。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的化學(xué)原理包括探針類(lèi)和非探針類(lèi)兩類(lèi),，探針類(lèi)是利用與靶細(xì)胞序列特異性雜交的探針來(lái)指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，非探針類(lèi)是利用熒光染料或者特異性設(shè)計(jì)的引物來(lái)指示擴(kuò)增的增加,。運(yùn)用該技術(shù)可以對(duì)DNA,、RNA樣品進(jìn)行定量（包括絕對(duì)定量和相對(duì)定量）和定性分析。

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