原代細胞培養(yǎng)技術


一,、組織塊直接培養(yǎng)法

1,、取材，用 Hank's 液洗滌三次,，并剔除脂肪,，結締組織，血液等雜物,。
2,、用手術剪將組織剪切成 1 mm³ 左右的小塊，再用 Hank's 液洗三次,。
3,、將組織塊轉移至培養(yǎng)瓶，并貼附于瓶底面,。
4,、輕輕將培養(yǎng)瓶翻轉，瓶底朝上,，向瓶內注入適量的培養(yǎng)液,，將培養(yǎng)瓶放置在 37 ℃ 恒溫箱內培養(yǎng)。
5,、放置待組織小塊貼附后,，將培養(yǎng)瓶慢慢翻轉平放，使組織浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起）,，37 ℃ 繼續(xù)培養(yǎng),。

二、消化培養(yǎng)法

1,、取材,，用 Hank's 液洗滌三次，并剔除脂肪,，結締組織,，血液等雜物。
2,、用手術剪將組織剪切成 1 mm³ 左右的小塊,，再用 Hank's 液洗三次。
3,、視組織塊量加入酶液,，37 ℃ 中消化 20～40 分鐘，每隔 5 分鐘振蕩一次,，或用吸管吹打一次,，使細胞分離。
4,、加入 3～5 mL 培養(yǎng)液以終止酶消化作用（或加入相關酶抑制劑）,。
5、靜置 5～10 分鐘,，使未分散的組織塊下沉,，取懸液加入到離心管中。
6,、1,000 rpm,，離心 10 分鐘，棄上清液,。
7,、加入 Hank's 液 5 mL，沖散細胞,，再離心一次,，棄上清液。
8,、加入培養(yǎng)液 1～2 mL（視細胞量）,，血球計數(shù)板計數(shù)。
9,、將細胞轉移到培養(yǎng)瓶中,，37 ℃ 下培養(yǎng)。

三,、 器官培養(yǎng)

1,、將不銹網(wǎng)做成支架形狀，調整其高度至培養(yǎng)皿的 1/2 深度平面,，在其表面放置 0.5 μm 孔徑濾膜,。
2、將培養(yǎng)液加入培養(yǎng)皿中,，使液面剛剛接觸到濾膜,，但不要使其浮起。
3,、將要培養(yǎng)器官組織放在濾膜上,，一般厚度不要超過 200 μm，水平面積不超過 10 mm²。
4,、將上述準備好的培養(yǎng)物放入 CO₂ 培養(yǎng)箱,，并加注氧氣調整氧分壓，最好到 90%,。
5,、培養(yǎng)過程中要注意觀察培養(yǎng)液平面，盡可能保持在與濾膜一致的水平上,。
6,、上述可進行器官培養(yǎng) 1～3 周，每 2～3 天換液一次,，并根據(jù)情況做進一步實驗和檢測,。
 

原代細胞傳代技術


一、貼壁細胞的消化法傳代

1,、吸除或倒掉瓶內舊培養(yǎng)液,。
2、加入 1 mL 左右消化液（胰蛋白酶或與 EDTA 混合液）輕輕搖動培養(yǎng)瓶,，使瓶底細胞都浸入溶液中,。
3、消化 2～5 分鐘后把培養(yǎng)瓶放置在顯微鏡下進行觀察,，發(fā)現(xiàn)原貼壁的細胞逐漸趨于圓形,，在還未漂起時，棄去消化液,，加入培養(yǎng)液終止消化,。
4、用吸管將貼壁的細胞吹打成懸液,，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中,，置 37 ℃ 培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。第二天觀察貼壁生長情況,。

二,、懸浮細胞的傳代

1、直接傳代
① 讓懸浮細胞慢慢沉淀在瓶底后,，將上清吸掉 1/2～2/3,。
② 用吸管吹打形成細胞懸液后，分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中,，置 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

2、離心法傳代
① 將細胞連同培養(yǎng)液一并轉移到離心管內,，離心 800-1,000 rpm,，5 分鐘,。
② 去除上清，加新的培養(yǎng)液到離心管內,，用吸管吹打使之形成細胞懸液,。
③ 將細胞懸液分別接種到另外兩到三個培養(yǎng)瓶中，置 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),。

 

原代細胞凍存技術


1,、選用生長情況好,，數(shù)量較多的原代細胞,，凍存前一天換液一次。
2,、貼壁細胞需用 0.25% 胰酶常規(guī)消化將細胞消化下來,，將細胞懸液收集至離心管中。
3,、1,000 rpm 離心 5 分鐘,，棄上清液。
4,、沉淀加含 DMSO 的培養(yǎng)液,，計數(shù)，調整至（1-10）×10⁶/mL,。
5,、將懸液分至凍存管中，每管 1 mL,。
6,、密封凍存管，封口一定要嚴,，否則復蘇時易出現(xiàn)爆裂,。
7、用記號筆標明細胞種類,，凍存日期,。
8、按下列順序降溫：室溫→4 ℃（20 分鐘〕→冰箱冷凍室（30 分鐘）→超低溫冰箱（-80 ℃ 過夜）→液氮,。

 

原代細胞復蘇技術


1,、取出細胞，迅速放入 37 ℃ 溫水中快速解凍,。
2,、吸出細胞懸液，并加 10 倍以上培養(yǎng)液,。
3,、1,000 r/分鐘離心 5 分鐘,，去除上清。
4,、用培養(yǎng)液適當稀釋后接種培養(yǎng)瓶,，放入 37 ℃ CO₂ 培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
5,、鏡檢細胞貼壁能力,。次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng),。

 

原代細胞鑒定技術


一,、形態(tài)學鑒定

1、在倒置顯微鏡中直接觀察活細胞的形態(tài)學特征
2,、細胞染色檢查 ：
a) 將無菌玻片置于細胞培養(yǎng)皿中,，加細胞懸液后培養(yǎng)；
b) 待細胞長滿玻片后取出,，用 PBS 清洗,，之后放于載玻片上，待其自然干燥,；
c) 用 PBS/甲醇（1:1）固定 15 分鐘,；
d) 棄固定液，加合適的染色液染色,；
e) 染色完畢后用清水洗凈,，置于空氣中干燥，
f) 干燥后,，用二甲本透明,，光學樹脂封片后觀察。

二,、免疫組織細胞化學鑒定

1,、將無菌的蓋玻片置于細胞培養(yǎng)皿中，將細胞懸液接種于培養(yǎng)皿中進行細胞爬片,；
2,、PBS  清洗標本 3 次，各 1 分鐘,；
3,、4% 多聚甲醛固定 15 分鐘；
4,、置于空氣中干燥,；
5、PBS 清洗標本 3 次,，各 2 分鐘,；
6,、0.5% Triton X-100  孵育 1 次 20 分鐘；
7,、PBS 清洗標本 3 次,，各 2 分鐘；
8,、3% H₂O₂  孵育 15 分鐘,；
9、DPBS  清洗標本 3 次,，各 2 分鐘,；
10、封閉血清孵育（5%  正常二抗血清 DPBS 液 20 分鐘）
11,、一抗孵育,，4 ℃ 過夜或 37 ℃ 60 分鐘,；
12,、PBS 清洗標本 3 次，各 5 分鐘,；
13,、二抗工作液孵育（濕盒）37 ℃ 30 分鐘；
14,、PBS 清洗標本 3 次,，各 5 分鐘；
15,、C 液（濕盒）37 ℃ 30 分鐘,；
16、PBS 清洗標本 3 次,，各 5 分鐘,；
17、用顯色液進行顯色,；
18,、蒸餾水洗滌 2 次 1 分鐘；
19,、蘇木素復染 1 分鐘,；
20、清水洗滌 30 分鐘,；
21,、光學樹脂封片后觀察。
 

原代細胞分離技術


取人或動物體內（或胚胎）的組織,，將其剪碎至 1 mm³ 的組織塊,，再采用的如下方法進行分離培養(yǎng)：
 

一,、懸浮細胞的分離方法


1、將血液,、羊水,、胸水或腹水等懸液直接轉至離心管中，1,000 rpm/分鐘離心 5 分鐘,。
2,、去掉上清，離心沉淀用無鈣,、鎂的 PBS 清洗后  1,000 rpm/分鐘離心 5 分鐘,。此步重復兩次。
3,、用培養(yǎng)基重懸,，調整適當細胞濃度后分瓶培養(yǎng)。
4,、如選用懸液中某種細胞,，可采用離心后的細胞分層液收獲目的細胞。

二,、實體組織材料的分離方法
 

（一）機械分散法


1,、纖維成分很少的腦組織，部分胚胎組織,，用剪刀剪碎至 1 mm³ 的組織塊,。
2、用 PBS 清洗兩次后
①用吸管吹打,，分散組織細胞,。
②或將已充分剪碎分散的組織放在注射器內（用九號針），使細胞通過針頭壓出,。
③或在不銹鋼紗網(wǎng)內用鈍物（注射器鈍端）壓擠使細胞從網(wǎng)孔中壓擠出,。
3、收集細胞轉入離心管中,，1,000 rpm/分鐘離心 5 分鐘,。
4、去上清,，加入含血清的培養(yǎng)基,，重懸后移至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。
 

（二）消化分離法


1,、酶消化分離法（過夜冷消化法）
①細胞間質較少的軟組織,，如肝、腎,、甲狀腺,、羊膜,、胚胎組織、上皮組織等,，用 Hanks 液清洗組織三次,，剪成碎塊大小為 4 毫米左右。
②再用 Hanks 液洗 2～3 次以除去血球和脂肪組織,。
③加入 0.25% 的胰蛋白酶,，搖勻后放 4 ℃ 過夜。
④次日再用 Hanks 液洗滌,，棄去上清,，共洗 2～3 次。
⑤加入少量含血清的培養(yǎng)基吹打分散,，細胞計數(shù),，按適當?shù)臐舛确制颗囵B(yǎng)。

2,、非酶消化法（EDTA  消化法）
①把組織塊剪碎,，呈 1 mm³ 大小的組織塊。
②將碎組織塊在平皿中用無鈣鎂 PBS 洗 2～3 次,。
③加入消化液（胰蛋白酶或膠原酶或 EDTA）于 37 ℃ 水浴中作用適當時間（中間可輕搖 1～2 次）,，若組織塊膨松呈絮狀可終止，若變化不大可更換一次消化液,，繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。
④棄去上清,，加入含有鈣,、鎂離子的培養(yǎng)基中止消化反應，并洗滌 2～3 次后,，加入wan全培養(yǎng)基,。
⑤用吸管吹打，使細胞充分散開后用紗網(wǎng)過濾后分瓶培養(yǎng),。

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