核酸分子雜交技術(shù)

由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的靈敏性，它已成為分子生物學(xué)中常用的基本技術(shù),，被廣泛應(yīng)用于基因克隆的篩選，酶切圖譜的制作,，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測等,。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強度等）可按堿基互補原成雙鏈。

雜交的雙方是待測核酸序列及探針（probe）,待測核酸序列可以是克隆的基因征段,，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA,。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的,，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補的已知DNA或RNA片段,。根據(jù)其來源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針,、寡核苷酸探針,、RNA探針等。

固相雜交

固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上,，再與探針進行雜交,，故也稱為膜上印跡雜交。

斑步雜交（dot hybridization）

是道先將被測的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進行雜交,。該法的特點是操作簡單,，事先不用限制性內(nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時進行多個樣品的檢測,；根據(jù)斑點雜并的結(jié)果,，可以推算出雜交陽性的拷貝數(shù)。該法的缺點是不能鑒定所測基因的相對分子質(zhì)量，而且特異性較差,，有一定比例的假陽性,。

印跡雜交（blotting hybridization）

Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上,，經(jīng)干烤固定,，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進行那時交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色,，檢測特定大小分子的含量,。可進行克隆基因的酶切圖譜分析,、基因組基因的定性及定量分析,、基因突變分析及限制性長度多態(tài)性分析（RELP）等。

Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來,，其被測樣品是RNA,。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上,，進行雜交反應(yīng),，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達常用的方法,，可推臬出癌基因的表達程度,。

差異雜交（differential hybridization）

是將基因組文庫的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交,，分析兩張濾膜上對應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達的基因,。適用于基因組不太復(fù)雜的真核生物（如酵母）表達基因的比較，假陽性率較低,。但對基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物（如人）,，則因工作量太大，表達的序列所占百分比較低（僅5％左右）,，價值不大,。

cDNA微點隈雜交（cDNA microarray hybridization）

是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點陣，然后用混合的不同DNA探針與微點陣上的DNA進行雜交,。再利用熒光,、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點陣上的雜交信息,。它比差異雜交技術(shù)的效率高,、速度快,、成本低,，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問世。其缺點是無法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾,。

寡核苷酸微點隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）

是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸,，使它共價結(jié)合于支持物表面，與平均長度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進行雜交,，以提高雜交的特異性和靈敏度,。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測跨越三個數(shù)量級的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測,，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達特征,，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大,、成本較高,、速度較慢等弱點。

液相雜交（solution hbridization）

指使變性的待測核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫,，使之形成雜交復(fù)合物,。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開,，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量,，就可推算出被測的核酸量。

遞減雜交（subtractive hybridizatio）

是利用兩種來源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）,在一定的條件下以過量的驅(qū)動mRNA或cDNA與測試的單鏈cDNA或mRNA進行液相雜交,，通過羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體,。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分,，保留特異表達的目的基因或工基因片段,。以后者篩選cDNA文庫，可獲得特異表達的目的基因cDNA全長序列,。

核酸原位雜交

用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級或組織切片中核酸進行復(fù)性雜交并對其實行檢測的方法,，稱為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來檢測DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布,，與細(xì)胞內(nèi)RNA進行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因表達水閏,；還用于細(xì)胞、組織中有無特異性菌,、病毒檢測的研究,。

該法的優(yōu)點是特異性高，可精確定位,；能在成分復(fù)雜的組織中進行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響,；不需要從組織中提取核酸，對于組織中含量極低的靶序列有ji高的敏感性,；并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài),。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究,，如基因定位、基因制失,，基因易位,、特異基因整合部物色檢測等研究。近年來由定性發(fā)展到定量,，方法更為完善,。

DNA分子克隆技術(shù)（也稱基因克隆技術(shù)）

在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆),。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接,，制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴增和表達,。

載體（vecors）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制,，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段,。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝,，有了這些與親本分子wan全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能,，隨著引入的DNA片段不同,，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomic library）,另一種是cDNA庫,。

載體　 所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細(xì)胞進行擴增和表達的工具,。

細(xì)菌質(zhì)粒 是一種細(xì)菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)的DNA，分子大小為1-20kb,，對細(xì)菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用,。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造拼接而成。常用的質(zhì)粒是pBR322,。

噬菌體（phaeg） 噬菌體是感染細(xì)菌的病毒,，按其生活周期分為溶菌型及溶原型兩型。用野生型λ噬菌體改造和構(gòu)建的噬菌體載體是線性雙鏈DNA,，基因組約為50kb,，常用的嘵菌體為λDNA及其衍生系列。

黏性質(zhì)粒（cosmid） 是由質(zhì)粒與噬菌體λDNA組成的一種4-6kb的環(huán)狀za種DNA,。

表達型載體 將上述細(xì)菌質(zhì)粒載體或噬菌體載體接上啟動基因及多聚核糖體的基因序列組成了表達型載體,。

基因庫的建造

含有某種生物體全部基歷的隨機片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子,，可以通過標(biāo)記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩選出來,，所得到的克隆經(jīng)過純化和擴增，可用于進 一步的研,。其主步驟包括：（1）構(gòu)建基因庫迅速的載體,；(2)DNA片段的制備,；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝和接種,。

cDNA庫的建造

是指克隆的DNA片段,，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自mRNA制備的cDNA,。cDNA庫包括某特定細(xì)胞的全部cDNA克隆的文庫,，不含內(nèi)含子。

特異基因的篩選

常用的方法有：

（1）克隆篩選即探針篩選法,；

（2）抗體檢測法,，檢測其分泌蛋白質(zhì)來篩選目的基因；

（3）放射免疫篩選法,，查出分泌特異抗原的基因,；

（4）免疫沉淀法,，進行特異基因的篩選,。

核酸序列測定

DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析 （測序,，sequencing）是分子生物學(xué)重要的基本技術(shù),。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴增的基因，最終均需進行核酸序列分析,，可藉以了解基因的精細(xì)結(jié)構(gòu),，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基因的突變及對功能的影響,，幫助人工俁成基因,、設(shè)計引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機制等,。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的,。

目前常用的方法有Maxam-Gilbert的化學(xué)降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動測定儀問世,?；瘜W(xué)降解法是在DNA的片段的5`端標(biāo)記核素，然后用專一性化學(xué)試劑將DNA特異地降解,，在電泳和自顯影后,，可得到從標(biāo)記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。

一般能讀出200-250個核苷酸序列,。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑,，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP,、ddTTP,、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入到DNA鏈中以終止鏈的延長,，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應(yīng)，這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一,、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段,，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列,，根據(jù)堿基互補原則,，可推算出模板DNA分子的序列。

化學(xué)降解法只需一化學(xué)試劑,，重復(fù)性好,，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板,、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶,，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運用，合成的引物容易獲得,，測序技術(shù)不斷改進,，故此法已被廣泛應(yīng)用?；撗醴ǖ淖詣蛹す鉄晒鉁y序儀,，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復(fù)性,。至于RNA測序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測序,，然后反推RNA序列

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)簡稱PCR技術(shù)，是一種利用DNA變性和復(fù)性原理在體外進行特定的DNA片斷高效擴增的技術(shù),，可檢出微量靶序列（甚至少到1個拷貝）,。在模板DNA、引物和四種脫氧核糖核苷酸存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促合成反應(yīng),。

僅需用極少量模板,，在一對引物介導(dǎo)下，在數(shù)小時 內(nèi)可擴增至100萬-200萬份拷貝,。PCR反應(yīng)分三步：變性,、退火及延伸。以上三步為一循環(huán),，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個的模板,，這樣經(jīng)過九小時的循環(huán)，每一循環(huán)的產(chǎn)物作為下一個循環(huán)的模板,，這樣經(jīng)過數(shù)上時的循環(huán)后,，可得到大量復(fù)制的特異性DNA片段。反應(yīng)條件一般為94℃變性30秒,，55℃退火30秒,，70-72℃延伸30-60秒,，共進行30次循環(huán)左右，最后再延伸72℃5分鐘,，4℃冷卻終止反應(yīng),。

1.逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)用來擴增RNA的方法。

2.競爭逆轉(zhuǎn)錄PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection C-RT-PCR)低豐度RNA定量的好方法,。

3.多重PCR（multiples PCR）在同一PCR體系中加入多對引物可用于基天長度很長,，發(fā)生多處缺失的檢測。擴增同一模板的幾個區(qū)域,。

4.多種PCR可同時加入多套以生物素標(biāo)記的引物起進手PCR反應(yīng),。

5.反向PCR（iverse polymerase chain reaction）對一個已知的DNA片段兩側(cè)的未知序列進行擴增和研究,。

6.不對稱PCR在擴增循環(huán)中引入不同引物濃度,，以得到單鏈DNA并進行列測定，以了解目的基因的序列,。

7.錨定PCR（anchored polymerase chain reaction）幫助克服序列未知或序列未全知帶來的障礙,。在未知序列未端添加同聚物尾序，將互補的引物連接于一段帶限制性內(nèi)切酶位點的錨上,，在錨引物和基因另一側(cè)特異性引物的作用下,，將未知序列擴增出來。

8.著色互補試驗或熒光PCR（color complementation assay or fluorescent PCR）原理是用不同熒光染粒,，分別標(biāo)記于不同寡核苷酸引物上,，同時擴增多個DNA片段，反應(yīng)完畢后,，利用分子篩選去多余的引物,。用紫外線照射擴增產(chǎn)物，就能顯示某一DNA區(qū)帶熒光染料顏色的組合,，如果某一DNA區(qū)帶熒光染色料顏色的組合,，如果某一DNA區(qū)帶缺失，則會缺乏相應(yīng)的顏色,。

9.雙溫PCR（two-temperature PCR）僅僅執(zhí)行兩步溫度程序,。合并退火與延伸溫度。一般常用溫度是94-95℃和46-47℃,?？梢蕴岣叻磻?yīng)的速度和特異性。

上述這些PCR技術(shù)的應(yīng)用：

（1）PCR技術(shù)擴增特定序列為基礎(chǔ),，采用多種方法進行檢測,，如PCR-RFLP、PCR-SSCP從已克隆的雙鏈DNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針,；（2）通過選擇性擴增cDNA中產(chǎn)生特異性序列作為分子探針,；

（2）通過選擇性擴增cDNA中的特殊片段,，產(chǎn)生針對尚未克隆的基因的探針；

（3）從微量mRNA中產(chǎn)生cDNA文庫,；

（4）產(chǎn)生大量用于序列分析的DNA,；

（5）分析 基因突變；（6）做染色體步移,。

10.原位PCR技術(shù)：PCR雖然能擴增包括福爾馬林固定,、石蠟包埋組織的各種標(biāo)本的DNA，但擴增的DNA或RNA產(chǎn)物不能在組織細(xì)胞中定位,，因而不能直接與特定的組織細(xì)胞特征相聯(lián)系,，這是該技術(shù)一個局限性。原位雜交雖具有良好的定位能力,，但由于其敏感性問題,，尤其是在石蠟切片中，尚不能檢測出低含量的DNA或RNA序列,。而原位PCR（In situ PCR,簡稱IS PCR）,，它可使擴增的特定DNA片段在分離細(xì)胞和組織切片中定位，從而彌補了PCR和原位雜交的不足,，具有良好的應(yīng)用前景,。目前，已有多種設(shè)計的原位PCR擴增儀系統(tǒng)問世,，使操作簡便,，軟件靈活，已成為拉增固定細(xì)胞和石蠟包埋組織中特定DNA和RNA序列的有用工具,。

IS PCR的技術(shù)特點

（1）既具有PCR的特異性與高靈敏性,，又具有原位雜交的定位準(zhǔn)確性；

（2）測到低于2個拷貝量的細(xì)胞內(nèi)特定DNA序列,，甚至可檢測出單一細(xì)胞中的僅含一個拷貝的原病毒DNA,；

（3）有助于細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列定位與其形態(tài)學(xué)變化的結(jié)合分析；

（4）可用于正?；驉盒约?xì)胞,，感染或非感染細(xì)胞的鑒定與區(qū)別。

IS PCR的基本方法

IS-PCR是PCR和原位雜交兩種技術(shù)的綾事,，實質(zhì)是一種將靶DNA或RNA在原位擴增后再進行原位雜交的技術(shù),，操作程序基本兼有兩種技術(shù)的所有過程，首先在適當(dāng)處理的細(xì)胞和組織切片上滴加PCR反應(yīng)液,，然后把載玻片放入熱循環(huán)儀中進行擴增,，最后通過標(biāo)記的探針進行原位雜交檢測擴增產(chǎn)物。

初步應(yīng)用

有關(guān)原位PCR技術(shù)應(yīng)用成功的第一篇報道是對感染綿羊中樞神經(jīng)系統(tǒng)visna病毒在綿羊脈絡(luò)從一細(xì)胞中檢查，通過PCR擴增,，僅用150堿基對的短探針就可通過ISH檢查到了細(xì)胞內(nèi)的visna病毒,。從開始在試管內(nèi)細(xì)胞行PCR擴增后再涂片做ISH(原位雜交)檢查，已發(fā)展到用福爾馬林固定,、石蠟切片的常規(guī)病理組織方法做原位PCR檢查,。有傳統(tǒng)的標(biāo)記探針的原位PCR法（間接法），也有將標(biāo)記物先標(biāo)記PCR的引物,，讓標(biāo)記物擴增后再行ISH檢查的直接法,。

因此，目前就原位PCR方法而言,，尚未能獲得統(tǒng)一,，也即未能比較出哪一種方法可靠簡便，各家報道的原位PCR技術(shù)中,，在標(biāo)本處理和種類上尚不同（細(xì)胞懸液,、涂片、組織切片等）,，想檢測的靶核酸也不同（病毒或體細(xì)胞的DNA或mRNA）,，擴增的方法上有不同（單引物,、多引物）,，最后顯示的方法也不同（直接法、間接法）,。這些還都有待在今后的工作中積累經(jīng)驗,，以求一致。

原位PCR應(yīng)用的課題,，目前正片于開始階段,，還很局限，對人體B細(xì)胞淋巴瘤中Ig單拷貝基因重組的檢查以及對人體外周血中單核細(xì)胞HLA-DQ不同亞型的測定,，歸納起來,，主要應(yīng)用于兩方面；

（1）檢測外源懷基因片段,，集中在病毒感染的檢查上,，如HIV、HPV,、HBV,、CMV等；

（2）內(nèi)源性基因片段,，如人體的單基yin病,、重組基因、易位的染色體,、Ig的mRNA片段,、癌基因片段等,。

基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

將特定的遺傳信息傳遞到真核細(xì)胞中，這種能力不但革新了生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中許多基本問題的研究,，也推動了診斷和治療方面的分子技術(shù)發(fā)展,，并使基因治療成為可能。目前基因轉(zhuǎn)移技術(shù)已廣泛用于基因的結(jié)構(gòu)和功能分析,、基因表達與調(diào)控,、基因治療與轉(zhuǎn)基因動物等研究。本部分將介紹目前基因轉(zhuǎn)移的主要方法,；重點介紹基因轉(zhuǎn)移的病毒方法的基因轉(zhuǎn)染（transfection）技術(shù),。

基因運載系統(tǒng)

將某一特定的靶基因傳遞到靶細(xì)胞，需要應(yīng)用某一基因運載系統(tǒng),，目前將這一系統(tǒng)概括為兩大類：非病毒辣方法和病毒方法,。

1.基因轉(zhuǎn)移的非病毒方法

直接注射法 將含有DNA的溶液直接注射到肌肉，以引起鄰近的細(xì)胞攝入DNA燕進行表達,，在肌細(xì)胞中,，基因表達可持續(xù)數(shù)月。

磷酸鈣共沉淀法 將氯化鈣,、DNA和磷酸鹽緩沖液混合,，形成磷酸鈣微沉淀 ，附著于細(xì)胞膜并經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)吞作用耐是入細(xì)胞質(zhì),。該方法的轉(zhuǎn)化效率通常很低,。

脂質(zhì)體染法 指質(zhì)體能在體內(nèi)或體外提供運載外源性遺傳物質(zhì)進入細(xì)胞的載體。脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移的優(yōu)勢在于能在活體內(nèi)應(yīng)用,。

受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移 依靠受體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)吞途徑以轉(zhuǎn)移外源基因,。受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移方法是在質(zhì)粒DNA和某種特異的多肽（配體）之間形成復(fù)合體，而這種多肽能為細(xì)胞表面的肥體所識別,。如若將DNA在體內(nèi)運送至肝內(nèi),，可以選將DNA和能與肝細(xì)胞受體特異結(jié)合的去唾液酸糖蛋白質(zhì)偶聯(lián)，以便通過細(xì)胞內(nèi)吞過程而被攝入,，這種DNA大部分被肝臟所攝取,。應(yīng)用該方法轉(zhuǎn)移的外源基因在活體內(nèi)的表達持續(xù)時間較短，在評估實際應(yīng)用前影上還在一些問題,。

顯微注射法 在顯微鏡下,，將DNA經(jīng)同細(xì)胞玻璃針地接注入細(xì)胞，該法適合于各種培養(yǎng)生長的細(xì)胞,，但需要一定的設(shè)備和操作用支巧,。

電穿孔法 利用脈沖場將DNA導(dǎo)入培養(yǎng)細(xì)胞。

微粒子轟擊法（基因槍）近幾年發(fā)展較快的轉(zhuǎn)移方法。使用高能微粒子轟擊將DNA導(dǎo)入培胞或活的哺乳動物組織內(nèi),。亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA,，將這些微彈加強速到很的速度轟擊細(xì)胞。實驗結(jié)果表明,，用這種方法靶基因可在皮膚,、肌肉、肝,、胰,、胃和乳腺等細(xì)胞中表達。

胚胎干細(xì)胞法 胚胎干細(xì)胞是從受精卵開始分裂至4個國胞階段未分化和具有多種潛能的生殖細(xì)胞,，能在體外培養(yǎng),，可作為正面細(xì)胞，制備轉(zhuǎn)基因動物,，以研究基因定向整合或基因剔險及基因及能,。

精子載體法 最近發(fā)現(xiàn)用精子和NDA-劑孵育，可捕獲得DNA,。通過受精過程,，將外源性基因?qū)胧芫眩刹东@得物物,，大大間化了轉(zhuǎn)基因動物的制備過程,。

2.基因轉(zhuǎn)移的病毒的方法

病毒作為基因轉(zhuǎn)移的是基因遞送有有并工具，病毒載體的優(yōu)點有：（1）在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中傳播重組的DNA分子作為穩(wěn)定的遺傳成分,；（2）在可能將有有制陷的或突變的基因置于病毒調(diào)節(jié)信號的控制下以進行研究,；（3）能將克隆的基因作為病毒微染色體的一部分 ，并能進分離,；（4）轉(zhuǎn)移效率較高。其主要缺點是病毒載體對外源基因的最大容納量只有2500bp,。目前常用的病毒載體有下列幾種,。

逆轉(zhuǎn)錄病毒載體 逆轉(zhuǎn)錄病毒辣為RNA病毒，它們的基因組編碼在一條單鏈RNA他婦上,，病毒進入細(xì)胞通過逆轉(zhuǎn)錄作用,，病毒RNA即轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈DNA分子，DNA進入細(xì)胞核并整合在細(xì)胞染色體中,，這種整合的病毒稱為原病毒,。在原病毒的兩端各有一長末端重復(fù)序列（LTR）,LTR內(nèi)側(cè)還有為復(fù)制所必需的其他順序，包括包裝信號,。目前常用的逆轉(zhuǎn)病毒載體有CMV和SV,。

DNA病毒載體 主要有腺病毒相關(guān)病毒載體，腺端正毒載體，皰疹病毒載體,。對DNA病毒載體的研究是當(dāng)前基因基因治療研究中的重點領(lǐng)域,。

常用的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)

將外源基因?qū)氚屑?xì)胞需要一定的載體和導(dǎo)入方法，基因轉(zhuǎn)技術(shù)則是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細(xì)胞內(nèi),，并在細(xì)胞內(nèi)表達,。轉(zhuǎn)染方法有多種，根據(jù)不同的細(xì)胞,，貼壁或懸浮細(xì)所可選用不同的方法,，其目的是要達到設(shè)置轉(zhuǎn)染效率，影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的因素有多種,，包括轉(zhuǎn)染方法,、操作技術(shù)、質(zhì)粒DNA的純度,、靶細(xì)胞的生長狀態(tài)等,，下面重點介紹向幾種常用的轉(zhuǎn)染技術(shù)：

靶細(xì)胞的準(zhǔn)備 被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，其生長狀態(tài)如何,，將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率,。如為貼壁生長的細(xì)胞，一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,，必需應(yīng)用胰酶處理成單細(xì)胞懸液,，重新接種于培養(yǎng)皿或瓶，細(xì)胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜,，轉(zhuǎn)染當(dāng)日,，在轉(zhuǎn)染前4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細(xì)胞,，也需在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液,。

靶基因質(zhì)粒DNA的準(zhǔn)備 用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì)，無RNA和其了化學(xué)物質(zhì)的污染,，OD260/280比值應(yīng)在1.8以上,。應(yīng)用酚-氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以達到此標(biāo)準(zhǔn)，目前大多采用進口的術(shù)提取純化試劑盒,。

具體的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)有鱗酸鈣介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法,、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染法及電擊基因轉(zhuǎn)導(dǎo)塵等,。靶基因被導(dǎo)入細(xì)胞后,，一般在轉(zhuǎn)染后48小時，靶基因即在細(xì)胞內(nèi)表達,。根據(jù)不同的實驗?zāi)康模?8小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗,。如若建立穩(wěn)定的細(xì)胞系,，則可對靶細(xì)胞進行篩選，根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物,，常用的直核表達基因載體的標(biāo)志物有潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）,。

轉(zhuǎn)基因動物的建立和應(yīng)用

轉(zhuǎn)基因動物是以實驗方法交源基因?qū)胨拗魇芫鸦蛟缙谂咛ゼ?xì)胞染色體基因組內(nèi)，使其穩(wěn)定整合和遺傳給后代動物,。它主要采用顯微注射法,、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染法、精子載體法,、電轉(zhuǎn)移法與胚胎干細(xì)胞法,。

轉(zhuǎn)基因動物模型的建立，推動了腫瘤在分子水平上的研究,，它使人們認(rèn)識到激活的原癌基因的異常表達及功能失常,，是腫瘤發(fā)生的初階段。將癌基因與特定細(xì)胞的調(diào)控序列連在一起,，可使癌基因在特定細(xì)胞中表達,，研究靶細(xì)胞對不同癌基因的易感性，闡明某一癌基因?qū)μ囟?xì)胞生長,、分化及功能的影響,；它還可以研究多種基因的協(xié)同作用，有助于對多步驟致癌機進行深和的探討,。

轉(zhuǎn)基因小鼠不但用以研究癌基因的功能,，還可以通過使某一基因功能丟失（如用基因剔除技術(shù)）研究抑癌基因在腫瘤發(fā)一中的作用。另外,，轉(zhuǎn)基因小鼠對致癌原的測試,，為腫瘤的預(yù)防，治療及發(fā)現(xiàn)新的致癌物質(zhì)都提供了有價值研究工具,。

基因突變的檢測方法

基因突變的研已成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的熱點之一,，檢測方法也隨之迅速發(fā)展。人類細(xì)胞癌基因的突變類型已如上所述,，對于基因突變的檢測,，1985以前，利用Southern印跡法,，可以篩選出基因的缺失、插入和移碼重組等突變形式,。對于用該法法不能檢測的突變,，只能應(yīng)用復(fù)雜費時的DNA序列測定分析法。

多聚酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）技術(shù)是突變研究中的最重大進展,，使基因突變檢測技術(shù)有了長足的發(fā)展,，目前幾乎所有的基因突變檢測的分子診斷技術(shù)都是建立于PCR的基礎(chǔ)之上,，并且由PCR衍生出的新方法不斷出現(xiàn)，目前已達二十余種,，自動化程度也愈來愈高,，分析時間大大縮短，分析結(jié)果的準(zhǔn)確性也有很大很提高,。其中包括單鏈構(gòu)象多態(tài)性（single-strand comformational polymorphism,SSCP）和異源雙鏈分析法（heteroduplex analysis,HA）,。下面分別介紹幾種PCR衍生技術(shù)及經(jīng)典突變檢測方法，可根據(jù)檢測目的和實驗室條件選擇時參考,。