酶的底物

　HRP的底物

HRP催化過氧化物的氧化反應(yīng),，最ju代表性的過氧化物為H2O2，其反應(yīng)式如下：

DH2+ H2O2 D+ H2O

上式中,，DH2為供氧體,，H2O2為受氫體。在ELISA中,，DH2一般為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色的產(chǎn)物,，以便作比色測定,。常用的供氫體有鄰苯二胺(O-phenylenediamine, OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine, TMB)和ABTS[2,2'-azino-di-(3- ethylbenziazobine sulfonate-6)],。

OPD氧化后的產(chǎn)物呈橙紅色,，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰,，靈敏度高,，比色方便，是HRP結(jié)合物最chang用的底物,。OPD本身難溶于水,，OPD•2HCL為水溶性。曾有報(bào)道OPD有致異變性,，操作時(shí)應(yīng)予注意,。OPD見光易變質(zhì)，與過氧化氫混合成底物應(yīng)用液后更不穩(wěn)定,，須現(xiàn)配置現(xiàn)用,。在試劑盒中，OPD和H2O2一般分成二組分,，OPD可制成一定量的粉劑或片劑形式,，片劑中含有發(fā)泡助溶劑，使用更為方便,。過氧化氫則配入底物緩沖液中,，有制成易保存的濃縮液，使用時(shí)用蒸餾水稀釋,。先進(jìn)的ELISA試劑盒中則直接配成含保護(hù)劑的工作濃度為0.02% H2O2的應(yīng)用液,只需加入OPD后即可作為底物應(yīng)用液,。

TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色，目視對(duì)比鮮明,。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定,，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液，可直接作底物使用,。另外,，TMB又有無致癌性等優(yōu)點(diǎn)，因此在ELISA中應(yīng)用日趨廣泛,。酶反應(yīng)用HCL或H2SO4終止后,，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計(jì)中定量,，最適吸收波長為405nm,。

ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低,，也為一些試劑盒所采用,。

另一種HRP的底物為3-(4-羥基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenly propionic acid,HPPA]，經(jīng)HRP作用后,，產(chǎn)物顯熒光,，可用熒光光度計(jì)測量。用于ELISA的優(yōu)點(diǎn)為可加寬定量測定的線性范圍,。

HRP對(duì)氫受體的專一性很高,，僅作用于H2O2、小分醇的過氧化物和尿素過氧化物(urea peroxide),。H2O2應(yīng)用最多,，但尿素過氧化物為固體，作為試劑較H2O2方便,、穩(wěn)定,。試劑盒供應(yīng)尿素過氧化物片劑，用蒸餾水溶解后,，在底物緩沖液中密閉,、低溫（2～8℃）可穩(wěn)定1年。

　AP的底物

AP為磷酸酯酶,，一般采用對(duì)硝基苯磷酸酯(p-nitrophenyl phosphate,p-NPP)作為底物,，可制成片劑，使用方便,。產(chǎn)物為黃色的對(duì)硝基酚,，在405nm波長處有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后,，黃色可穩(wěn)定一時(shí)間,。

AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定,，敏感度較高于用顯色底物的比色法,。

　酶反應(yīng)終止液

常用的HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液的最終體積而異，在板式ELISA中一般采用2mol/L,。