1.提蛋白

（不同細(xì)胞類型的蛋白或細(xì)胞不同部位的蛋白提取方法或有不同,，需要提前查找資料）

我用的是上海白益生物公司的全蛋白提取試劑盒 一般是取100 mg 標(biāo)本 + 1 ml lysis buffer + 10 ul 磷酸酶抑制劑 + 10ul PMSF + 1 ul 蛋白酶抑制劑 放入研磨器研磨,，直至研磨成勻漿（注意冰上操作，有的試劑盒說明在研磨時(shí)加液氮）,，倒入EP管,，放入離心機(jī)離心，12,000 g / 5 min,，取上清,。

另一種提蛋白試劑，用RIPA buffer (Gibco) + 1% cOmplete™, EDTA-free Protease Inhibitor (Sigma)

20mg樣品（盡量吸盡PBS） + 150 ul RIPA 溶液

冰上放置5~30min（趕時(shí)間可短）

蛋白定量-BCA測定方法（酶標(biāo)板操作）

（如果不同樣品總蛋白表達(dá)量以及蛋白組分差異大,，總蛋白調(diào)齊之后還需要看內(nèi)參蛋白的表達(dá)是否一致,，最后可根據(jù)內(nèi)參蛋白調(diào)整上樣量）

BSA標(biāo)準(zhǔn)品一般需用PBS稀釋液稀釋（按照protocol來）。釋待測樣品至合適濃度,，使樣品稀釋液（稀釋后濃度一般不超過測得標(biāo)準(zhǔn)品的最高濃度）,，總體積為20 μL。據(jù)樣品數(shù)量,，按50體積BCA試劑A加1體積BCA試劑B ( 50:1 ) 配制適量BCA工作液,，充分混勻，每孔加入200 μL BCA工作液,。

37℃放置30分鐘（可調(diào)整時(shí)間）后,，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號管做參比，在562 nm波長下比色,，記錄吸光值,。以蛋白濃度 ( μg/ul )為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo),，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線 y = 0.554x+0.0034

據(jù)所測樣品的吸光值（此處為y值）Average of triplicate,， 代入y = 0.554x+0.0034 得到蛋白濃度x值，乘以稀釋倍數(shù),。根據(jù)蛋白上樣量確定體積（如上樣總體積16ul (加 混勻的4x Laemmli+β-巰基乙醇 煮沸變性),，上樣量20ug，測得蛋白濃度5ug/ul,，則取蛋白提取液體積 volume = 20/5 = 4ul）,，補(bǔ)PBS 8ul，再加4x Laemmli 4ul, 使上樣體積相等,。一般99℃水浴變性5min（變性可嘗試不同時(shí)間,，如3min、7min或更長）,，保存于-80℃,。

（4x Laemmli 也可換成 5x loading buffer）加入5x loading buffer (即80ul 樣本 加 20ul loading buffer )，搖勻,，可用封口膜封口 (防止煮沸時(shí)EP管口因壓力高而彈開) 煮沸變性（溫度時(shí)間根據(jù)蛋白可做相應(yīng)調(diào)整）,。

2. wb

2.1 配膠

蛋白分子量大小不同，所使用的分離膠濃度也不同,，常用濃度有6%,、8%、10%,、12%,，分子量越大，所用的膠濃度越低,，蛋白電泳速度越快,。濃縮膠濃度均為 5%。分離膠的選擇：蛋白分子量很小時(shí),，推薦使用10-12%,，例如蛋白分子量為 21kd 和 34kd ，選取的膠濃度為10%,；分子量80kd,，選10%；分子量180kd,，選6%,。

[電泳液也可用BIO-RAD 10x Tris/Glycine/SDS buffer, 直接取100ml buffer + 900ml 純水稀釋即可。配膠可用TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%或其它濃度]

加樣之前先簡單介紹一下,。一般wb,、免疫熒光、免疫組化等組織病理學(xué)實(shí)驗(yàn)樣本要求是每組不低于3個(gè),，需要相互比較的組別加樣時(shí)放于同一塊膠上,。測目標(biāo)蛋白之前先跑內(nèi)參蛋白,，檢測各樣本的蛋白提取量是否相近。內(nèi)參蛋白量一致,，再測目標(biāo)蛋白,。一般我用GAPDH作為內(nèi)參蛋白（不同組織有區(qū)別），分子量~35kd,。marker作為指示劑可以顯示目標(biāo)蛋白所處的條帶位置及大概分子量,，一般加3～5ul。至于目標(biāo)蛋白,，不同蛋白表達(dá)量不同,，一般10～20ug，可根據(jù)第一次的結(jié)果進(jìn)行調(diào)整,。

2.2 電泳

電泳時(shí)長一般1.5h,，先用80v 跑~30min，使各樣本處于同一水平,，待marker開始分離后將電壓調(diào)至120v 再跑~1h,。待loading buffer提示快跑出分離膠時(shí)，準(zhǔn)備配制轉(zhuǎn)膜液,。配方如圖,。

2.3 轉(zhuǎn)膜（濕跑法）

轉(zhuǎn)膜是整個(gè)wb過程中最重要的一步。Glycine14.1 g + Tris 3 g +800 ml 純水配好后,，放入冰袋預(yù)冷，之后加甲醇 800ml,。PVDF膜一般為2 x 8 cm 大小,。PVDF膜和膠要時(shí)刻保持濕潤，不能干,。將PVDF膜放入裝有甲醇的培養(yǎng)皿中活化~15秒,，再倒入轉(zhuǎn)膜液。轉(zhuǎn)膜時(shí)要注意趕走膜與膠之間的氣泡,。轉(zhuǎn)膜板如下圖,，在兩層濾膜之間依次放入膠和PVDF膜（膠對應(yīng)轉(zhuǎn)膜板黑色面/儀器黑色面-連接電源負(fù)極，PCDF膜對應(yīng)轉(zhuǎn)膜板透明面/白色面/儀器紅色面-連接電源正極）,。注意轉(zhuǎn)膜儀器正負(fù)極與電源相對應(yīng),。

轉(zhuǎn)膜時(shí)長和蛋白分子量有關(guān)，一般100 kb以內(nèi)的蛋白,，轉(zhuǎn)膜時(shí)長1kb / 1min,，大于100kb，改為1kb / 1.5分鐘,。一般是恒流 200mA,，加冰袋,；分子量大時(shí)，可用300mA,，隔1h 換1次冰袋,，因?yàn)檗D(zhuǎn)膜過程會(huì)產(chǎn)生大量熱量，避免儀器燒壞,。

（半干轉(zhuǎn)膜法）

可用BIO-RAD Trans-Blot Turbo 5x Transfer Buffer (1份 20ml) + ethanol (1份 20ml) + nanopure water (3份 60ml) (需預(yù)冷)

2A~2.5A,，恒壓25V，10min（可根據(jù)需要改變條件）BIO-RAD儀器,。

2.4 封閉和敷一抗

將PVDF膜放入封閉液（1% milk in 1x TBST + 0.1% Tween 20 ）中,，室溫下封閉~1h，也可根據(jù)需要延長至1.5h,。封口膜大小一般3.5 x 10.5cm（可用封閉盒,，盡量用純水或TBST清洗）。置于搖床上慢速搖~1h后,，置于4℃冰箱過夜,。

（驗(yàn)證抗體很重要）

2.5 敷二抗和顯影

取出PVDF膜（條帶），用TBST洗滌3次,，5min /次,。若抗體效價(jià)不是很好，可適當(dāng)延長每次的洗滌時(shí)間,。再用相同的封閉液稀釋二抗,，置于搖床上搖1h。之后取出條帶再用TBST洗滌3次,，5min /次,。配顯影液，我用的是MILLIPORE品牌的,，比例1:1,，注意避光(可用錫箔紙)。每條帶滴約200ml 顯影液,。

顯影成像時(shí)因不同曝光時(shí)間會(huì)影響成像效果,，最好取欠曝光，適度曝光以及過度曝光多個(gè)曝光時(shí)間,，取差異最大的圖像,。

tips: 剛從新鮮組織提前的蛋白記得搖勻分裝，應(yīng)盡量在早期多做點(diǎn)wb條帶圖,，便于后期數(shù)據(jù)補(bǔ)充分析,，提取的蛋白存放時(shí)間久以及反復(fù)凍融，會(huì)導(dǎo)致蛋白降解,，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性,。

wb房間沒有空調(diào),，夏天溫度太高導(dǎo)致膠很快就凝了，可以將玻璃板放在冰上預(yù)冷,，冬天用純水可以壓平分離膠,，夏天可以用異丙醇壓平。

TEMED具有神經(jīng)毒性和揮發(fā)性,，應(yīng)在通風(fēng)口處使用,，避免搖晃，避光低溫存儲(chǔ),。

因答主測量的蛋白分子量比較靠近,，之前一塊膠只轉(zhuǎn)了一個(gè)蛋白，最近在想直接對整塊膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,，對不同蛋白進(jìn)行半定量分析,，這樣既能減少上樣誤差，還可以直觀的看出不同蛋白間的變化趨勢,。所以試了下對整塊膠進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,，加入兩種抗體，此處一抗種屬來源不同,，因此二抗也不一樣,，最后條帶結(jié)果并不理想。目前還在摸索是否為抗體濃度的因素,。

另外,，如果是發(fā)好的paper，建議將膜保留下來,，注意保濕（可保存8～9個(gè)月）,，部分投稿雜志會(huì)要求作者提供。

今天面試,，教授們提了一個(gè)問題，希望與大家共勉,。如何確定wb中特異性抗體結(jié)合的蛋白就是我們要的目標(biāo)蛋白,，上海白益首先可以根據(jù)分子量大小判斷，可以做共沉淀把目標(biāo)蛋白拉下來送去做質(zhì)譜,?？梢詫δど系牡鞍鬃錾V和質(zhì)譜聯(lián)合分析，另外特異性染色也可以做,，抗二抗的抗體可以購買或者自己制作,。

通過向同學(xué)深入的學(xué)習(xí)，還可以做陰性對照和陽性對照,。陰性對照（確定不表達(dá)或極微量表達(dá)目標(biāo)蛋白的樣品）,，比如基因敲除動(dòng)物,，對動(dòng)物做DNA鑒定，確定沒有該蛋白對應(yīng)的基因序列,，再提取蛋白做wb,。陽性對照（確定表達(dá)目標(biāo)蛋白的樣品），比如某種模型或正常組就是會(huì)比該種實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷谋磉_(dá)高,，可以做wb進(jìn)行比較,。

技術(shù)是一種手段，但是嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目蒲兴季S以及善于探索很重要,。