酶聯(lián)免疫吸附實驗

1.原理：免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理,，對待測抗體或者抗原進(jìn)行分析測定的方法,，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個部分組成：免疫識別,，信號輸出和數(shù)據(jù)處理,。

2.步驟：免疫識別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識別待測的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物,，病毒,，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測液中將抗原吸附到96孔板表面,。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）,、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識別信號。最后利用信號強度,，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計算得出待測樣中目標(biāo)抗原的濃度,。

3.分類：根據(jù)免疫識別和信號輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法,、直接免疫競爭法和非直接免疫競爭法等等,。其中雙抗體夾心法在商業(yè)應(yīng)用上最常見。

雙抗體夾心法：

1.抗體包被 在96孔板上包被抗體,。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成,，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用,，可以將抗體吸附于其表面,。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后,，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分,。加入封閉液的目的,，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號,，干擾后續(xù)實驗的進(jìn)行,。

2.免疫識別 在96孔板上包被抗體后，加入待測樣,，并在37°C環(huán)境下孵育一段時間，通常是1-2小時,。此時酶標(biāo)板上的抗體與待測抗原進(jìn)行特異性識別結(jié)合,。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測樣中其他生物大分子,、蛋白質(zhì)和無機鹽等成分的影響,。

3.洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對應(yīng)的識別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時,，接著將未連接上抗原的抗體洗掉,。

4.酶標(biāo)信號輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合,。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗,，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度,。一般認(rèn)為,，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強度呈正相關(guān)。

間接法

1.將特異性抗原與固相載體連接,，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì),。

2.加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物,。經(jīng)洗滌后,，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合,，在洗滌過程中被洗去,。

3.加酶標(biāo)抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接記上酶,。洗滌后,，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。例如欲測人對某種疾病的抗體,，可用酶標(biāo)羊抗人IgG抗體,。

4.加底物顯色：顏色深度代表標(biāo)本中受檢抗體的量。

* elisa間接法法只要更換不同的固相抗原,，可以用一種酶標(biāo)抗抗體檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體,。

免疫競爭法

以抗原競爭抗體為例,，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原,，使之與待測抗原競爭識別酶標(biāo)板上的抗體,。當(dāng)待測抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少,，輸出的信號就越少,。這樣待測樣濃度與酶顯色信號就呈逆相關(guān)。