PCR 引物設(shè)計(jì)的十個(gè)基本原則：
1,、引物zuì好在模板 cDNA 的保守區(qū)內(nèi)設(shè)計(jì)：
DNA 序列的保守區(qū)是通過物種間相似序列的比較確定的,。搜索不同物種的同一基因,，通過序列分析軟件比對(duì)，各基因相同的序列就是該基因的保守區(qū),。
 
2,、引物長(zhǎng)度一般在15~30堿基之間：
引物長(zhǎng)度(primer length)常用的是18-27 bp，但不應(yīng)大于38,，因?yàn)檫^長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃,，不適于Taq DNA 聚合酶進(jìn)行反應(yīng)。
 
3,、引物 GC 含量在 40%~60% 之間,，Tm值zuì好接近 72℃：
上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解鏈溫度。有效啟動(dòng)溫度,，一般高于 Tm 值 5~10℃,，其 Tm 值zuì好接近 72℃ 以使復(fù)性條件zuì佳。
 
4,、引物 3′ 端要避開密碼子的第 3 位：
如擴(kuò)增編碼區(qū)域,，引物 3′ 端不要終止于密碼子的第 3 位，因密碼子的第 3 位易發(fā)生簡(jiǎn)并,，會(huì)影響擴(kuò)增的特異性與效率,。
 
5、引物 3′ 端不能選擇 A,，zuì好選擇 T：
當(dāng)末位鏈為 T 時(shí),，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G,、C 錯(cuò)配的引發(fā)效率介于 A,、T 之間，所以 3′ 端zuì好選擇 T ,。
 
6,、堿基要隨機(jī)分布：
降低引物與模板相似性的一種方法是，引物中四種堿基的分布zuì好是隨機(jī)的,，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在,。
 
7、引物自身及引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列：
引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,，否則引物自身會(huì)折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)使引物本身復(fù)性,。
 
8、引物的 5′ 端可以修飾，而 3′ 端不可修飾：
引物 5′ 端修飾包括：加酶切位點(diǎn),；標(biāo)記生物su,、熒光、di高辛,、Eu3+等,，引物的延伸是從 3′ 端開始的，不能進(jìn)行任何修飾,。
 
9,、擴(kuò)增產(chǎn)物的單鏈不能形成二級(jí)結(jié)構(gòu)：
某些引物無效的主要原因是擴(kuò)增產(chǎn)物單鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，選擇擴(kuò)增片段時(shí)zuì好避開二級(jí)結(jié)構(gòu)區(qū)域,。
 
10,、引物應(yīng)具有特異性：
引物設(shè)計(jì)完成以后，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行 BLAST 檢測(cè),。如果與其它基因不具有互補(bǔ)性,，就可以進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)了。