循環(huán)次數(shù) ：一般為25 a～ 30次。循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低,，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無限增加的,。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右,，循環(huán)數(shù)超過30個(gè)以后，DNA聚合酶活性逐漸達(dá)到飽和,，產(chǎn)物的量不再隨循環(huán)數(shù)的增加而增加,，出現(xiàn)了所謂的“平臺(tái)期"。

循環(huán)參數(shù)如下:

1.預(yù)變性

模板DNA*變性與PCR酶的*激活對(duì)PCR能否成功至關(guān)重要,，建議加熱時(shí)間參考試劑說明書,，一般未修飾的Taq酶激活時(shí)間為兩分鐘。

2.變性步驟

循環(huán)中一般95℃,，30秒足以使各種靶DNA序列*變性,，可能的情況下可縮短該步驟時(shí)間。變性時(shí)間過長(zhǎng)損害酶活性,，過短靶序列變性不*,，易造成擴(kuò)增失敗。

3.引物退火

退火溫度需要從多方面去決定,，一般根據(jù)引物的Tm值為參考,，根據(jù)擴(kuò)增的長(zhǎng)度適當(dāng)下調(diào)作為退火溫度。然后在此次實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上做出預(yù)估,。退火溫度對(duì)PCR的特異性有較大影響,。

4.引物延伸

引物延伸一般在72℃進(jìn)行（Taq酶最適溫度）。但在擴(kuò)增長(zhǎng)度較短且退火溫度較高時(shí),，本步驟可省略延伸時(shí)間隨擴(kuò)增片段長(zhǎng)短而定,，一般推薦在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生設(shè)定為1min/kbp,。

5.循環(huán)數(shù)

大多數(shù)PCR含25-35循環(huán),，過多易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增。

6.最后延伸

在最后一個(gè)循環(huán)后,，反應(yīng)在72℃維持10-30分鐘．使引物延伸*,，并使單鏈產(chǎn)物退火成雙鏈。