佰利萊生物為您講解PCR反應效率低值解析

反應效率視為實時熒光定量PCR 分析設計和優(yōu)化的關鍵因素,。利用標準曲線(通過對目標模板進行連續(xù)梯度稀釋獲得) 獲取效率值,。該效率值可作為總反應的“健康"標志。低效率與高效率所造成的影響有所不同,。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠,。理想的反應效率為100%,，但反應效率在90–110% 范圍內(nèi)都是可以接受的,。

 確定某個特定的分析效率是否低下的方法是稀釋模板生成標準曲線(模板稀釋的范圍應涵蓋所有未知樣本),，然后查看該范圍內(nèi)的效率。它應盡可能接近100%,。熔解曲線出現(xiàn)多個峰或凝膠顯示多種產(chǎn)物意味著反應源物質(zhì)之間存在競爭作用,，這必將對反應效率產(chǎn)生影響。一旦確定反應被抑制或效率較低,，則可采取一些步驟將效率值重新調(diào)整到理想范圍內(nèi),。

1,、對于抑制作用,，可去除模板濃度zui高的反應孔并重新分析標準曲線。如果效率重新回到110% 以下,，則分析良好,。

2、另一種解決方案是重新純化模板,。切記應延長干燥時間,，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除,。

3,、通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題。此過程有時相對簡單,，但在某些情況下,，隨著分析復雜度的提高，優(yōu)化過程可能十分耗時費力,。

4,、擴增單個產(chǎn)物時，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應效率,，但當出現(xiàn)競爭作用時,，則應降低鎂的濃度。

5,、在某些情況下(主要是多重反應中),，必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì),。此時，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度,，有時甚至還需檢測探針比值,，以找出分析的理想濃度組合。引物濃度介于100至600nM之間,，而探針濃度則在100nM至400nM 之間,。

6、根據(jù)引物的Tm 值,，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當,，且引物設計時使之有相似的Tm 值。