佰利萊生物為您講解PCR反應(yīng)效率低值解析

反應(yīng)效率視為實時熒光定量PCR 分析設(shè)計和優(yōu)化的關(guān)鍵因素,。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線(通過對目標(biāo)模板進(jìn)行連續(xù)梯度稀釋獲得) 獲取效率值,。該效率值可作為總反應(yīng)的“健康"標(biāo)志,。低效率與高效率所造成的影響有所不同。改善上述兩種情形的步驟則相差甚遠(yuǎn),。理想的反應(yīng)效率為100%,，但反應(yīng)效率在90–110% 范圍內(nèi)都是可以接受的。

 確定某個特定的分析效率是否低下的方法是稀釋模板生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(模板稀釋的范圍應(yīng)涵蓋所有未知樣本),，然后查看該范圍內(nèi)的效率,。它應(yīng)盡可能接近100%。熔解曲線出現(xiàn)多個峰或凝膠顯示多種產(chǎn)物意味著反應(yīng)源物質(zhì)之間存在競爭作用,，這必將對反應(yīng)效率產(chǎn)生影響,。一旦確定反應(yīng)被抑制或效率較低，則可采取一些步驟將效率值重新調(diào)整到理想范圍內(nèi),。

1,、對于抑制作用，可去除模板濃度zui高的反應(yīng)孔并重新分析標(biāo)準(zhǔn)曲線,。如果效率重新回到110% 以下,，則分析良好。

2,、另一種解決方案是重新純化模板,。切記應(yīng)延長干燥時間，以去除乙醇沉淀過程中的乙醇,，或采用另外的柱上洗滌液將離液鹽從硅膠純化物中去除,。

3、通過分析優(yōu)化可解決效率低下的問題,。此過程有時相對簡單,，但在某些情況下，隨著分析復(fù)雜度的提高,，優(yōu)化過程可能十分耗時費力,。

4、擴增單個產(chǎn)物時,，將鎂的濃度提升至6mM 可提高反應(yīng)效率,，但當(dāng)出現(xiàn)競爭作用時，則應(yīng)降低鎂的濃度,。

5,、在某些情況下(主要是多重反應(yīng)中)，必須采用引物和探針優(yōu)化基質(zhì),。此時,，需檢測正向引物與反向引物的比值或濃度，有時甚至還需檢測探針比值,，以找出分析的理想濃度組合,。引物濃度介于100至600nM之間，而探針濃度則在100nM至400nM 之間,。

6,、根據(jù)引物的Tm 值，確保熱循環(huán)條件(尤其是退火溫度)適當(dāng),，且引物設(shè)計時使之有相似的Tm 值,。