細(xì)菌（Bacteria）環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）ELISA檢測試劑盒
檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品,、HRP標(biāo)記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并全部洗滌。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的環(huán)二鳥苷酸（c-di-GMP）呈正相關(guān),。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值）,，計(jì)算樣品濃度。
樣品收集,、處理及保存方法
1.  血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離,。
2.  血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。
3.  細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物,。
4.  組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘
取上清,。
5.  保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測,，請按一次用量分裝，凍存于-20℃,，避免反復(fù)凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品

1. 酶標(biāo)儀（450nm）

2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL

3. 37℃恒溫箱

操作注意事項(xiàng)

1.   試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶全部溶解后再使用。

2.   實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。

3.   濃度為0的S0號標(biāo)準(zhǔn)品即可視為陰性對照或者空白；按照說明書操作時(shí)樣本已經(jīng)稀釋5倍,，最終結(jié)果乘以5才是樣本實(shí)際濃度,。

4.   嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作,。

5.   所有液體組分使用前充分搖勻,。注：標(biāo)準(zhǔn)品（S0-S5）濃度依次為：0、100,、200,、400、800,、1600 ng/mL
   試劑的準(zhǔn)備
    20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。
   洗板方法

6.   手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液,，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次,。

7.   自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min,，洗板5次,。

8. 操作步驟

9.   從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃,。

10.   設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；

11.   樣本孔先加待測樣本10μL,，再加樣本稀釋液40μL,；空白孔不加。

12.   除空白孔外,，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。

13.   棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。

14.   每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。

15.   每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。

16. 結(jié)果判斷
     繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo),，對應(yīng)OD值作縱坐標(biāo),，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值,。

17. 試劑盒性能

18.  準(zhǔn)確性：標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900。

19.  靈敏度：最少檢測濃度小于1.0 ng/mL,。

20.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。

21.  重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%,。

22.  貯藏：2-8℃,，避光防潮保存。

23.  有效期：6個(gè)月

24. 免責(zé)聲明
      試劑盒僅供研究使用,，不得用于臨床實(shí)驗(yàn)或細(xì)菌體實(shí)驗(yàn),，否則所產(chǎn)生的一切后果,，由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān)，本公司概不負(fù)責(zé),。

25.   嚴(yán)格按照說明書操作,，實(shí)驗(yàn)者違反說明書操作，后果由實(shí)驗(yàn)者承擔(dān),。