一,、   貼壁細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）

1、 吸出原培養(yǎng)液,；

2,、 加入2ml左右PBS，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶潤洗細(xì)胞,，吸出PBS丟棄,；

3、 加入1ml左右胰酶,，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶使之浸潤所有細(xì)胞,，放入培養(yǎng)箱消化；

4,、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同,，顯微鏡下看到細(xì)胞塊中間的細(xì)胞顯著分離變圓，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化,，全程不要拍打培養(yǎng)瓶,；

5、 加入3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,，奏樂細(xì)胞使之脫落并在液體里反復(fù)奏樂使細(xì)胞,，使之盡量呈單顆細(xì)胞的懸浮液,，這時(shí)可以在顯微鏡看下；

6,、 收集細(xì)胞懸液離心，1200rpm（約250g）  3分鐘,，離心完吸出上清丟棄,。

7、 加入新鮮培養(yǎng)基,，奏樂幾下混勻細(xì)胞即可,，按需接種到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基,，擰松瓶蓋或使用透氣瓶蓋進(jìn)行培養(yǎng),。

8、 檢查培養(yǎng)箱二氧化碳,，溫度和水盤,。

二、   懸浮細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）

1,、 輕輕吹散懸浮細(xì)胞,，部門貼壁疏松的懸浮細(xì)胞可直接奏樂培養(yǎng)瓶底部使細(xì)胞懸浮，收集細(xì)胞懸液到無菌離心管中,，離心1200rpm（約250g）  3分鐘,，離心完畢吸出上清丟棄;

2、 加入適量新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，按比例接種至培養(yǎng)瓶（接種比例按實(shí)際情況,，不確定可計(jì)數(shù)后再接種）;

3、 常規(guī)細(xì)胞推薦以3~5×10⁵cells/ml傳代,，長到2×10⁶cells/ml傳出;

4,、 建議剛開始幾代計(jì)數(shù)后傳代，后面可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)按比例傳代,。

三,、     半貼壁半懸浮細(xì)胞傳代（以一個(gè)T25瓶為例）

1、 培養(yǎng)液（含懸浮的細(xì)胞）：用移液器吸出培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到無菌離心管中,；

2,、 貼壁部門：用1ml  PBS洗細(xì)胞，吸出PBS放入到第1步裝有培養(yǎng)液的離心管中收集（不要直接丟棄,，里面有細(xì)胞）,；

3、 培養(yǎng)瓶加入胰酶1ml,，放入培養(yǎng)箱靜置消化,；

4,、 消化時(shí)間跟據(jù)細(xì)胞特性有所不同，顯微鏡下看到細(xì)胞顯著收縮變圓,，側(cè)立培養(yǎng)瓶細(xì)胞可以滑落時(shí)可終止消化,，全程不要拍打培養(yǎng)瓶；

5,、 用3ml含血清的培養(yǎng)基終止消化,，將消化下來的細(xì)胞懸液吹散細(xì)胞后收集到第1步的離心管；

6,、 將離心管在1200rpm（約250g）  3min離心,，離心完畢棄掉上清，加入新的培養(yǎng)基重懸,，按實(shí)際情況分瓶,，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

溫馨提示：

1,、 每丟棄一個(gè)液體前都要想一下里面有沒有可能有細(xì)胞,，避免丟失細(xì)胞。

2,、 細(xì)胞種類,、細(xì)胞密度、細(xì)胞狀態(tài),、甚至胰酶的品牌,，均影響到細(xì)胞的消化時(shí)間，所以消化的時(shí)候不要只看時(shí)間,，以顯微鏡下細(xì)胞的狀態(tài)來確定消化終點(diǎn),，部門難消化的細(xì)胞消化時(shí)間甚至可以長達(dá)15分鐘。

3,、 細(xì)胞的傳代比例通常說的是等體積的容器,，不同容器需要換算；例如：一個(gè)T25培養(yǎng)瓶的細(xì)胞傳到一個(gè)10cm培養(yǎng)皿里面,，固然是1傳1,，但是比例可不是1:1；T25瓶底面積25cm2,，10cm培養(yǎng)皿底面積約為55cm2（10cm的培養(yǎng)皿指的是培養(yǎng)皿的外徑,，而培養(yǎng)皿的內(nèi)徑約為8.4cm，故根據(jù)內(nèi)徑可求出其底面積為55cm2）,，所以實(shí)際傳代比例為1:2.2,。

4、 在有關(guān)離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)中,，尺度的離心前提應(yīng)該是用RCF(relative  centnifugal  fieldt)來衡量,，而在實(shí)際大家實(shí)驗(yàn)過程中,，往往習(xí)慣用rmp即每分鐘轉(zhuǎn)速來表示；RCF即表示相對離心場,，以重力加速度g(980.66cm/s2)的倍數(shù)來表示,；RCF=1.119×10-5×(rpm)2×r（其中r表示離心機(jī)轉(zhuǎn)軸中央與離心管中央的間隔，單位為cm）,；所以每個(gè)實(shí)驗(yàn)室離心機(jī)轉(zhuǎn)速設(shè)置是不一樣的,，常規(guī)建議1200rpm  大約250g。