將動(dòng)物機(jī)體的各種組織從機(jī)體中取出,，經(jīng)各種酶(常用胰蛋白酶),、螯合劑(常用EDTA)或機(jī)械方法處理,，分散成單細(xì)胞,，置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞得以生存,、生長(zhǎng)和繁殖，這一過(guò)程稱(chēng)原代培養(yǎng),。

　　原代細(xì)胞培養(yǎng)的步驟一般是：取材→分離→培養(yǎng)和維持,，今天我們重點(diǎn)介紹原代細(xì)胞的取材和分離方法。

　　一,、取材

　　人和動(dòng)物細(xì)胞的取材是原代細(xì)胞培養(yǎng)成功的首要條件,，直接影響細(xì)胞的體外培養(yǎng)。

　　取材的基本要求：

　?、?取材要注意新鮮和保鮮

　?、?應(yīng)嚴(yán)格無(wú)菌

　?、?防止機(jī)械損傷

　　④ 去除無(wú)用組織和避免干燥

　?、?應(yīng)注意組織類(lèi)型,、分化程度、年齡等

　?、?作好記錄

　　各類(lèi)組織的取材技術(shù)：

　?、?皮膚和粘膜的取材

　　主要取自于手術(shù)過(guò)程中的皮片，方法似外科取斷層皮片手術(shù)操作,，但面積一般2~4平方厘米,。

　　② 內(nèi)臟和實(shí)體瘤的取材

　　內(nèi)臟除消化道外基本是無(wú)菌的,，但取材時(shí)要明確和熟悉所需組織的類(lèi)型和部位,，實(shí)體瘤取材時(shí)要取腫瘤細(xì)胞豐富的區(qū)域，要避開(kāi)破潰,、壞死液化部分,，以防污染，盡量去除混雜的結(jié)締組織,。

　?、?血液細(xì)胞的取材

　　血細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的取材,，一般多抽取靜脈外周血,，或從淋巴組織中(如脾、扁桃體,、胸腺,、淋巴結(jié)等)分離細(xì)胞，取材時(shí)應(yīng)注意抗凝,。

　?、?骨髓、羊水,、胸/腹水細(xì)胞取材

　　嚴(yán)格無(wú)菌,，注意抗凝，還要盡快分離培養(yǎng),，離心后,，用無(wú)鈣、鎂PBS洗兩次,，再用培養(yǎng)液洗一次后即可培養(yǎng),，不宜低溫存放。

　?、?動(dòng)物組織取材

　　I 鼠胚組織取材

　　首先用引頸或氣管窒息致死法處死孕期合適的動(dòng)物,，然后將其整個(gè)浸泡在含有75%酒精的燒杯中,，5分鐘后(注意時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免酒精從口或其他通道進(jìn)入體內(nèi),，影響組織活力),，取出動(dòng)物，在消毒過(guò)的木板上可用無(wú)菌的圖釘或大頭針固定四肢,，切開(kāi)皮膚,，用無(wú)菌操作法解剖取胚或用無(wú)菌止血鉗挾起皮膚、用無(wú)菌眼科剪沿軀干中部環(huán)形剪開(kāi)皮膚,，用止血鉗分別挾住兩側(cè)皮膚拉向頭尾,，把動(dòng)物反包，暴露軀干,，然后再固定,，更換無(wú)菌解剖器材，采用無(wú)菌操作法解剖取出胚胎,。

　　II 幼鼠胚腎(或肺)取材

　　幼鼠采用上述方法處死消毒后,，腹部朝上固定在木板上，先切開(kāi)游離毛皮并拉開(kāi)至兩側(cè)：然后采用無(wú)菌法打開(kāi)胸腔取肺,，或背部朝上固定在木板上，先將背部毛皮切開(kāi)游離并拉向兩側(cè),，然后采用無(wú)菌法從背部打開(kāi)腹腔取腎,。

　　⑥ 雞(鴨)鳥(niǎo)類(lèi)胚胎組織取材步驟

　　1,、取孵化至適當(dāng)胚齡(9~12天)的胚蛋,，用照蛋燈在暗處燈檢，若有豐富血管,、胚體有運(yùn)動(dòng)的胚蛋,，說(shuō)明胚體發(fā)育良好，并用有色筆劃出氣室和胚體位置,。

　　2,、將胚蛋置于蛋架上，先用溫水清洗蛋殼,，再用75%酒精棉球擦干;

　　經(jīng)碘酒,、75%酒精消毒后，在無(wú)菌條件下采用無(wú)菌法用剪刀或鑷子打開(kāi)氣室,，沿氣室邊緣去除蛋殼;

　　3,、用眼科鑷撕去殼膜，暴露出雞胚;

　　4,、用彎頭鑷輕挑起胚頭,，取出胚胎,，放入無(wú)菌平皿中，解剖取材,。

　　二,、原代細(xì)胞的分離

　　人或動(dòng)物體內(nèi)(或胚胎組織)由于多種細(xì)胞結(jié)合緊密，不利于各個(gè)細(xì)胞在體外培養(yǎng)中生長(zhǎng)繁殖,，必須將現(xiàn)有的組織塊充分散開(kāi),，使細(xì)胞解離出來(lái)。

　　1,、懸浮細(xì)胞的分離方法

　　組織材料若來(lái)自血液,、羊水、胸水或腹水的懸液材料,，最jian單的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘,。經(jīng)離心后由于各種細(xì)胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細(xì)胞,。

　　2,、實(shí)體組織材料的分離方法

　　對(duì)于實(shí)體組織材料，由于細(xì)胞間結(jié)合緊密,，為了使組織中的細(xì)胞充分分散,，形成細(xì)胞懸液，可采用機(jī)械分散法(物理裂解)和消化分離法,。

　?、?機(jī)械分散法

　　特點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速,但對(duì)組織機(jī)械損傷大,，而且細(xì)胞分散效果差,適用于處理纖維成分少的軟組織,。

　　② 消化分離法

　　組織消化法是把組織剪切成較小團(tuán)塊(或糊狀),，應(yīng)用酶的生化作用和非酶的化學(xué)作用進(jìn)一步使細(xì)胞間的橋連結(jié)構(gòu)松動(dòng),，使團(tuán)塊膨松，由塊狀變成絮狀,，此時(shí)再采用機(jī)械法,，用吸管吹打分散或電磁攪拌或在搖珠瓶中振蕩，使細(xì)胞團(tuán)塊得以較充分的分散,，制成少量細(xì)胞群團(tuán)和大量單個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液,，接種培養(yǎng)后，細(xì)胞容易貼壁生長(zhǎng),。

　?、?酶消化分離法

　　酶消化分離法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和膠原酶(Sigma/Life)

　　胰蛋白酶是一種胰臟制品，對(duì)蛋白質(zhì)有水介作用,，主要作用于賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵,，使細(xì)胞間質(zhì)中的蛋白質(zhì)水介而使細(xì)胞分散開(kāi),。

　　膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶，對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用,。適于消化纖維性組織,、上皮組織以及癌組織，它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用,。

　　除上述兩種zui常用的消化酶外,，還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶,、蝸牛酶,、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶

　?、?非酶消化法(EDTA消化法)

　　EDTA是一種非酶消化物,，又稱(chēng)螯合劑或Versene，全名為乙烯二胺四乙酸,。常用不含鈣,、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液，對(duì)一些組織,，尤其是上皮組織分散效果好,，該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物,，利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離,。

　　Ⅲ 消化分離法的操作步驟

　　剪切.加液漂洗.消化.棄去消化液.漂洗.機(jī)械分散

　?、?消化分離法的注意事項(xiàng)

　　組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用,。

　　胰蛋白濃度不宜過(guò)高,，作用時(shí)間不能太長(zhǎng)，以避免毒性作用,。

　　消化后組織不僅要盡量棄去消化液,，以避免毒性產(chǎn)生，而且動(dòng)作要輕,，避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失,。