一,、質(zhì)粒
質(zhì)粒是一種環(huán)狀的小分子 DNA,，是進行 DNA 重組的常用載體，在分子生物學(xué)研究和基因治療中對于質(zhì)粒的產(chǎn)量和質(zhì)量都有一定的要求,，其中超螺旋比例和內(nèi)毒素含量是影響質(zhì)粒質(zhì)量的兩個重要因素,。
雖然超螺旋通常是主要形式，但在所有質(zhì)粒制備中,，切口和線性DNA形式通常作為次要形式回收,。
但是，如果操作不當(dāng)?shù)脑?，超螺旋形式?/span>DNA質(zhì)粒的收獲率可能不高,，那么如何提高質(zhì)粒DNA的超螺旋比例呢？
二,、提高質(zhì)粒超螺旋比例的方法
（1）在生長平臺期收獲細菌培養(yǎng)物
在對數(shù)生長過程中過早收獲細菌時,，經(jīng)常會看到帶切口的 DNA。為避免分離出大量帶切口的DNA,，建議收獲進入生長平臺期（生長12-16小時后）的細菌,。
（2）不要渦旋和輕輕移液
如果在質(zhì)粒分離過程中將制備物渦旋或過度劇烈搖晃,，則可能會因DNA的機械剪切而出現(xiàn)切口或線性DNA。所以建議輕輕混合,，不要渦旋,，輕輕少量地移液。
（3）切勿過度使用堿性裂解液
堿性裂解是從基因組DNA中分離質(zhì)粒DNA關(guān)鍵步驟,，但如果過度使用,，則可能通過將質(zhì)粒長久變性為單鏈環(huán)狀形式來長久破壞質(zhì)粒的超螺旋。所以建議將裂解的孵育時間保持在推薦的時間,，并在此步驟中非常輕柔地混合,。
（4）小心處理質(zhì)粒重懸液
風(fēng)干后質(zhì)粒重懸期間可能會發(fā)生剪切。質(zhì)粒越大,，發(fā)生剪切的可能性就越大,。沉淀后輕柔處理制備物，讓DNA吸收到水中,，而不是劇烈吹打,。
（5）避免核酸內(nèi)切酶
某些細菌菌株含有核酸內(nèi)切酶A（endA+），可以線性化DNA,。建議將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到endA–菌株中,，則盡可能高效地進行質(zhì)粒制備，以快速將DNA從酶中移開,。
（6）保持低溫
有研究表明在較低溫度（4-12°C）下執(zhí)行所有步驟會增加回收的超螺旋質(zhì)粒的量
三,、舉例
如圖所示，質(zhì)粒提取之后進行瓊脂糖凝膠電泳,，開環(huán)質(zhì)粒的占比約20%,，說明超螺旋比例低，一般超螺旋比例需要＞90%,，一般來說超螺旋比例越高,，質(zhì)粒的穩(wěn)定性越高，高超螺旋比例的質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染效率,、基因表達水平等方面具有更好的表現(xiàn),。
原因：裂解時間不宜過長，加入裂解液后裂解時間不應(yīng)超過5分鐘,，以免質(zhì)粒受到破壞
解決方法：優(yōu)化裂解時間,；確保質(zhì)粒的結(jié)合和所有溶液都在室溫下進行，減少離心力對質(zhì)粒超螺旋結(jié)構(gòu)的影響,，因為過度的離心可能會破壞質(zhì)粒的超螺旋結(jié)構(gòu),。
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