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qpcr結果和wb結果不一致？是什么原因呢,？今天讓我們來探討一下~

一,、實驗技術層面的原因

(1) 樣品制備與處理

在qPCR中,，如果總RNA樣品提取環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤,，如取材到液氮速凍耗時過長導致RNA降解，或在制樣時沒有保持低溫環(huán)境,、沒有有效防范外源性RNA酶的污染,，都可能影響RNA的質量和qPCR結果的準確性。

在WB實驗中,，蛋白樣品制備環(huán)節(jié)同樣至關重要,。如果取材到液氮速凍耗時過長或制樣時沒有保持低溫環(huán)境，可能導致蛋白降解,。此外,，如果沒有加蛋白酶抑制劑,，也可能導致蛋白降解。另外,，如果蛋白發(fā)生可逆性沉淀,，如低溫保存時蛋白濃度高導致沉淀，或pH值過低導致蛋白沉淀,，也會影響WB結果的準確性,。

(2) 實驗操作的精確性

在進行qPCR時，如果引物設計策略有誤,、引物形成二聚體,、熔合曲線呈現(xiàn)雙峰，或引物實際擴增效率未檢測而默認為100%計算,，都可能導致結果不準確,。

在WB實驗中，如果電泳,、轉膜,、抗體孵育、發(fā)光成像等環(huán)節(jié)出現(xiàn)失誤,，如電泳電壓不穩(wěn)定,、轉膜不wanquan、抗體濃度不合適,、曝光時間不當?shù)?，也會影響結果的準確性。

二,、生物學層面的原因

(1) 翻譯后調控或修飾

有時蛋白的mRNA水平可能保持不變,，但經(jīng)過翻譯過程后蛋白的產(chǎn)量顯著增加。因此,，即使mRNA水平?jīng)]有變化,，也可能出現(xiàn)蛋白水平升高的情況。相反,，如果存在一些影響翻譯過程的因素,，也可能導致mRNA水平高而蛋白水平低的情況。

同時,，蛋白質在合成后可能會經(jīng)歷各種翻譯后調控或修飾過程,，如磷酸化、糖基化,、泛素化等,。這些修飾過程可能影響蛋白質的穩(wěn)定性、活性或定位，從而導致WB結果與qPCR結果不一致,。

(2) 延遲效應

蛋白質合成需要耗費時間,，而mRNA表達則能迅速響應外界刺激。因此,，在某些情況下,，mRNA的變動可能比蛋白質水平的變化來得早或晚，導致兩者之間的結果不一致的情況,。

(3) mRNA剪接多變數(shù)

轉錄后的mRNA可能產(chǎn)生多種剪接體,。而qPCR往往只針對其中一段進行擴增和檢測。因此,，即使檢測到的mRNA水平下降了,，其他剪接體可能正在增加，導致蛋白質水平反而上升,，這種現(xiàn)象需要我們特別留意,。

(4) 蛋白翻譯后的穩(wěn)定性

蛋白在翻譯后可能會經(jīng)歷各種修飾，這些修飾可能會影響蛋白的穩(wěn)定性,。舉例來說,，增加泛素化修飾可能會促進蛋白通過蛋白酶體途徑進行降解，從而導致蛋白水平下降,。

(5) 負反饋機制調節(jié)

細胞內存在負反饋機制來調節(jié)mRNA和蛋白質的水平,。有時蛋白的mRNA水平可能保持不變，但經(jīng)過翻譯過程后蛋白的產(chǎn)量顯著增加,。因此,，即使mRNA水平?jīng)]有變化，也可能出現(xiàn)蛋白水平升高的情況,。相反,，如果存在一些影響翻譯過程的因素，也可能導致mRNA水平高而蛋白水平低的情況,。這種動態(tài)平衡機制可能導致mRNA和蛋白質水平在不同時間點出現(xiàn)不一致,。

三、數(shù)據(jù)處理與分析層面的原因

(1) 定量方法的差異

qPCR和WB分別采用不同的定量方法,。qPCR通過檢測熒光信號的變化來實時定量PCR擴增產(chǎn)物量的變化,；而WB則通過抗體與蛋白質的結合來檢測蛋白質的表達水平。這兩種方法可能在定量范圍和靈敏度上存在差異,，導致結果不一致,。

(2) 結果解讀的主觀性

在進行WB結果分析時，通常需要根據(jù)蛋白質條帶的顏色和深淺來判斷蛋白質的表達水平,。這種判斷過程存在一定的主觀-性，可能導致不同研究者對同一結果產(chǎn)生不同的解讀,。

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