一,、制備細胞生長培養(yǎng)基
所使用的培養(yǎng)基將取決于所使用的細胞類型。例如:
使用無菌技術(shù)在II級安全帽下工作,。
二,、在顯微鏡下檢查細胞
在生長過程中，應(yīng)該每天檢查細胞,，以確保它們健康并按預(yù)期生長,。它們應(yīng)該主要附著在燒瓶的底部，形狀圓而豐滿或細長,，并在其膜周圍折射光線,。這表明他們是健康的。
介質(zhì)應(yīng)該是粉橙色,。如果細胞大量分離和/或看起來干癟和顆粒狀/顏色深,，則丟棄細胞，不要用于檢測,。
三,、制備細胞懸浮液
1. 所有細胞處理和培養(yǎng)基制備應(yīng)在II類安全柜中使用無菌技術(shù)進行。
2. 當(dāng)細胞融合70-80%時,，它們?nèi)詰?yīng)處于生長的對數(shù)階段,，可用于電鍍。
3. 首先將培養(yǎng)基在37°C水浴中加熱至少30分鐘,。
4. 準(zhǔn)備好后,，小心地從一個175平方厘米的培養(yǎng)皿中倒入所需細胞的培養(yǎng)基（含有實驗室消毒劑）,，注意不要增加任何滴入的污染風(fēng)險。
5. 立即更換,，小心地倒入100毫升預(yù)熱好的新鮮培養(yǎng)基,。
6. 使用細胞刮板，輕輕刮掉燒瓶底部的細胞到培養(yǎng)基中,。有些細胞系可能需要胰蛋白酶化,。在繼續(xù)之前，檢查燒瓶底部,，檢查所有的細胞是否脫落,。
7. 確保待計數(shù)的細胞懸浮液通過輕搖瓶混合均勻。必要時可使用血清學(xué)移液管,。
8. 在細胞wan全有機會沉淀之前,，使用血清學(xué)移液管取出約1ml細胞懸液，并將其放置在附注管中,。
9. 用血細胞計進行細胞計數(shù),。
四、獲得正確的細胞密度
使用下面的計算得到正確的細胞密度,。這應(yīng)該是4.5 × 105個細胞/mL左右,，但需要根據(jù)細胞系進行優(yōu)化。
N = df
45 × 104
N是每毫升細胞數(shù)
DF是計算出來的稀釋系數(shù)
由于細胞在100ml培養(yǎng)基中,，接下來的計算是：
100 mL x稀釋因子
這將給出細胞應(yīng)該在的介質(zhì)體積的值,。
用血清學(xué)移液管加入適量的預(yù)熱培養(yǎng)基。
例子:
如果細胞計數(shù)為55 × 104/mL,，有100 mL細胞懸液：
55 × 104細胞/mL = 1.22
45 × 104細胞/mL
100毫升× 1.22 = 122毫升
因此,，對于45 × 104/mL的細胞懸浮液，在100 mL細胞懸浮液中加入22 mL預(yù)熱培養(yǎng)基,。
如果正確細胞密度所需的體積小于100ml：
將細胞倒入50ml離心管中,。
在離心機中以100轉(zhuǎn)/分旋轉(zhuǎn)10分鐘，確保離心機平衡,。
小心地倒出上清,。
將細胞顆粒重懸于所需體積的預(yù)熱培養(yǎng)基中。
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