DNA聚合酶是催化DNA或RNA為模板合成DNA的一類酶的總稱,,又稱DNA依賴的DNA聚合酶(DNA—dependent DNA polymerase,DNA pol),,它是以親代DNA為模板,,催化底物dNTP分子聚合形成子代DNA的一類酶。此酶是美國科學家Arthur Komberg于1957年在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)的,,被稱為DNA聚合酶Ⅰ(DNA polymerase Ⅰ,,簡稱polⅠ)以后陸續(xù)在其他原核生物及真核生物中找到了多種DNA聚合酶。這些聚合酶的共同特點是:它們都能把脫氧核糖核苷酸(dNTP)連續(xù)的加到雙鏈DNA引物鏈的3'-羥基末端上,,催化核苷酸的聚合,,形成新的DNA鏈。
PCR DNA聚合酶的種類包括Taq DNA聚合酶,、高保真DNA聚合酶、熱啟動DNA聚合酶,、等溫擴增DNA聚合酶和鏈置換DNA聚合酶等,。
一、PCR DNA聚合酶:
1. Taq DNA聚合酶
特點:Taq DNA聚合酶是從水生棲熱菌中分離提取的,,具有很高的熱穩(wěn)定性,,能夠在70℃保持活性,適合標準的PCR反應,。它缺乏3’→5’核酸外切酶活性,,因此無校正功能,容易產生錯配堿基,。
應用:用于常規(guī)PCR擴增,,尤其是當對保真度要求不高時。其擴增產物3’末端帶有A尾,,可直接用于TA克隆,。
2. 高保真DNA聚合酶
特點:這類酶具有3’→5’核酸外切酶活性,能夠校正錯誤插入的核苷酸,,顯著降低錯配率,。常見的有Pfu、KOD,、Phusion等,。
應用:適用于需要高保真度的應用場景,如基因克隆,、定點突變,、測序及SNP分析等,。例如,Hieff Canace® Plus High-Fidelity DNA Polymerase具有很高的保真性和擴增效率,,適用于復雜模板的高保真擴增,。
3. 熱啟動DNA聚合酶
特點:通過化學修飾或抗體結合,在室溫下抑制其活性,,直到高溫激活,。這種酶可減少非特異性擴增,提高PCR反應的特異性和靈敏度,。
應用:適用于需要高特異性擴增的實驗,,如多重PCR、復雜模板的擴增等,。例如,,Hieff Union Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase能夠有效防止非特異性擴增,并提高擴增特異性,。
4. 等溫擴增DNA聚合酶
特點:這類酶具有鏈置換活性和5’→3’聚合酶活性,,能在恒溫條件下進行快速、高效,、特異性擴增,。
應用:適用于等溫擴增技術,如LAMP,、CPA,、RCA等。例如,,Bst Ⅱ Plus DNA Polymerase具有更高的靈敏度,、擴增效率和穩(wěn)定性,且增加了dUTP耐受性,,非常適合基于等溫擴增技術的應用,。
5. 逆轉錄DNA聚合酶
特點:這類酶以RNA為模板,,按5’→3’方向合成互補DNA(cDNA),,常用于研究基因表達。
應用:用于將RNA轉錄為DNA,,如RT-PCR,、qRT-PCR等。常用的逆轉錄酶包括M-MLV和AMV,。
6. 鏈置換DNA聚合酶
特點:具有強鏈置換活性,,可以在DNA復制過程中取代舊鏈,常用于等溫擴增技術,。
應用:適用于基于鏈置換的等溫擴增反應,,如LAMP和滾環(huán)擴增(RCA),。例如,Bca best聚合酶和phi29 DNA聚合酶在擴增速度,、產量和熱穩(wěn)定性方面都有優(yōu)異的表現(xiàn),。
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