細(xì)胞培養(yǎng)幾乎是所有細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ),。其中，細(xì)胞傳代是將部分細(xì)胞分離出來(lái),，重新接種到新的培養(yǎng)皿中,，使細(xì)胞重新獲得足夠的營(yíng)養(yǎng)條件和生長(zhǎng)空間的過(guò)程。對(duì)于貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞,，細(xì)胞密度長(zhǎng)到80%-90%時(shí),，細(xì)胞狀態(tài)最好，此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代,。下面讓我們一起來(lái)看看貼壁細(xì)胞傳代的方法和注意事項(xiàng)吧,！
一、貼壁細(xì)胞傳代（以T25瓶為例）
1.顯微鏡下觀察細(xì)胞匯合度大于80%即可傳代,；
2.將移液管,、移液槍、T25培養(yǎng)瓶,、1ml槍頭,、PBS溶液等放入超凈工作臺(tái)，紫外燈滅菌30min后再通風(fēng)30min,；
3.培養(yǎng)基放置37℃水浴鍋預(yù)熱,；
4.將胰酶和培養(yǎng)基用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；
5.在培養(yǎng)箱內(nèi)旋緊培養(yǎng)瓶瓶蓋,，拿出細(xì)胞,，用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái)；
6.吸棄上清液,；
7.用5mlPBS液潤(rùn)洗細(xì)胞,，吸棄PBS；
8.培養(yǎng)瓶加入1ml胰酶,，輕輕晃動(dòng)使胰酶充分覆蓋細(xì)胞層,，放入培養(yǎng)箱中孵育；
9.在顯微鏡下觀察細(xì)胞解離狀況,，細(xì)胞明顯變圓,、細(xì)胞間隙增大，輕輕晃動(dòng)可呈現(xiàn)流沙狀即可終止,；
10.加入4ml培養(yǎng)基終止消化,，吹打細(xì)胞層表面數(shù)次，使其分散成單個(gè)細(xì)胞,；
11.收集細(xì)胞懸液到50ml離心管中,，1000-1200r/min離心,，3-5min去除胰酶；
12.離心管用75%酒精消毒后放入超凈工作臺(tái),，吸棄上清液,，用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞；
13.將細(xì)胞懸液按推薦傳代比例分裝到培養(yǎng)瓶,，補(bǔ)充適量培養(yǎng)基,，搖晃使細(xì)胞分布均勻，并做好標(biāo)記,；
14.在顯微鏡下觀察細(xì)胞密度及狀態(tài),，把細(xì)胞放回培養(yǎng)箱，旋松瓶蓋以便進(jìn)行氣體交換,。
二,、注意事項(xiàng)：
1.PBS潤(rùn)洗細(xì)胞時(shí)，從與貼壁細(xì)胞層相對(duì)的容器一側(cè)輕輕加入PBS,，避免沖刷到細(xì)胞層,；
2.不同細(xì)胞的胰酶所需消化時(shí)間不一樣，消化時(shí)間根據(jù)細(xì)胞貼壁特性而定,，可每30s觀察一次,。
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