細胞復蘇是指將凍存在液氮或者-70℃冰箱中的細胞解凍之后重新培養(yǎng),，細胞恢復生長的過程。當恢復到常溫狀態(tài)時,，細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)保持正常,，生化反即刻恢復。細胞復蘇過程升溫要快,，原則是慢凍快融,，防止在解凍過程中水分進入細胞，形成冰晶,，影響細胞存活,。下面讓我們一起來看看細胞復蘇實驗的操作步驟與注意事項吧！
一,、操作步驟
1.將10ml移液管,、移液槍、1ml槍頭,、50ml離心管,、T25培養(yǎng)瓶、酒精燈、廢液缸等物品放入超凈工作臺,，紫外燈照射30min后再通風30min,；
2.預熱培養(yǎng)基；
3.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺,；
4.將凍存細胞從液氮罐中取出,；
5.放入一次性手套于37℃水浴鍋中快速晃動使其融化；
6.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺,；
7.吸取9ml培養(yǎng)基到50ml離心管中,；
8.用1ml槍頭吸取解凍的細胞懸液于離心管中；
9.1000r/min,離心5min,；
10.用75%酒精消毒后放入超凈工作臺,；
11.吸棄上清液；
12.吸取1ml培養(yǎng)基重懸細胞,，將細胞懸液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶內(nèi),，補加適量培養(yǎng)基，輕輕晃動培養(yǎng)瓶使細胞分布均勻,，并做好標記,；
13.在顯微鏡下觀察復蘇的細胞密度及狀態(tài)；
14.將細胞放回二氧化碳培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),。
二,、注意事項
1.從液氮罐中取出細胞時，應做好個人防護以免凍傷,；
2.凍存細胞取出后,，如不能立即放入水浴鍋中融化，需將其放在干冰上保存轉(zhuǎn)移,；
3.細胞水浴解凍時間以1min內(nèi)為宜,，做到慢凍速融；
4.已解凍的細胞避免長時間常溫存放,，需盡快離心去除DMSO,；
5.剛復蘇的細胞貼壁尚不牢固，24h內(nèi)不要頻繁觀察和換液,；
6.將培養(yǎng)瓶放入培養(yǎng)箱,，并將瓶蓋旋松，以便進行充分的氣體交換(如使用透氣性瓶蓋,，則無需旋松瓶蓋)。
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