細胞克隆形成實驗是用來檢測細胞增殖能力,、侵襲性,、對殺傷因素敏感性等項目的重要技術方法,?？寺⌒纬梢罁捎玫呐囵B(yǎng)介質的不同，可分為平板克隆和軟瓊脂克隆兩類,。那么你知道這兩種細胞克隆實驗的操作方法嗎,？讓我們一起來看看吧！
一,、平板克隆
1. 所需材料
基礎培養(yǎng)基（根據細胞選擇適用種類）
胎牛血清,、胰蛋白酶、PBS,、青霉素-鏈霉素溶液（100X）,、多聚甲醛固定,、結晶紫染液、Giemsa染液,、
2. 實驗步驟
（1）6孔板
1）將處于對數生長期的細胞胰酶消化后,，wan全培養(yǎng)基（基礎培養(yǎng)基+10%胎牛血清）重懸成細胞懸液，并計數,；
2）細胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實驗組接種400-1,000個細胞/孔（根據細胞生長情況確定,，一般為700個細胞/孔）;
3）繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數單個克隆中細胞數大于50為止，中途每隔3天進行換液并觀察細胞狀態(tài),；
4）克隆完成后,，在顯微鏡下對細胞進行拍照，然后PBS洗滌1次,，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min,，PBS洗滌1次；
5）每孔加入結晶紫染液1ml,，染細胞10-20 min,；
6）PBS 洗滌細胞數次，晾干,，數碼相機拍照（分別對整個六孔板及每個孔進行單獨拍照）,。
（2）平皿
1）取對數生長期的各組細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞,，并把細胞懸浮在wan全培養(yǎng)基（基礎培養(yǎng)基+10%胎牛血清）中備用,。
2）將細胞懸液作梯度倍數稀釋，每組5個平行樣,。每組細胞每皿分別接種100個細胞于含10ml 37℃預溫培養(yǎng)液的皿中,，并輕輕轉動，使細胞分散均勻,。
3）置37℃,、5% CO2及飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。
4）當培養(yǎng)皿中出現肉眼可見的克隆時,，終止培養(yǎng),。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次,。
5）加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml,，固定15分鐘。
6）去固定液,，加適量Giemsa應用染色液染10～30分鐘
7）用流水緩慢洗去染色液,，空氣干燥。
8）將平皿倒置并疊加一張帶網格的透明膠片，用肉眼直接計數克隆,，或在顯微鏡（低倍鏡）計數大于10個細胞的克隆數,。最后計算克隆形成率。
克隆形成率=（克隆數/接種細胞數）×100%
3. 數據分析
顯微鏡下觀察陽性克隆,，即每個克隆>50個細胞,，相機拍照，數克隆數（大小約在0.3-1.0 mm）計算克隆形成率,，并統計克隆大小,。
二、軟瓊脂克隆形成
軟瓊脂克隆形成又名非錨定依賴性生長實驗Anchorage-independent assay,，利用軟瓊脂為培養(yǎng)介質,，使細胞在懸浮狀態(tài)下生長。
某些惡性腫瘤細胞,，不僅在貼壁狀態(tài)下能增殖,，在懸浮狀態(tài)下也能增殖，進而通過軟瓊脂中形成克隆的能力反映了惡性程度,，可用于細胞分化的基礎研究和臨床腫瘤治療的療效檢驗等方面,。
1. 實驗步驟
1）配制1.2% 和0.7%瓊脂，高壓滅菌后,，維持在42℃中使其不會凝固,；
2）將1.2% 瓊脂與2×培養(yǎng)基混合，鋪入6孔板作為下層膠,，每孔1.5ml,，37°C孵育30 min使之凝固；
3）將制備好的單細胞懸液與0.7%瓊脂充分混勻,，加入6孔板作為上層膠,，每孔1.5ml。待其凝固后,，再在上面加入培養(yǎng)基,，每3天更換一次；
4）根據細胞的生長速度培養(yǎng)2~3周后顯微鏡下觀察克隆大小,，與平板克隆一樣,，每個克隆>50個細胞，顯微鏡拍照,。若拍整個孔,，每孔加入200μl氯化硝基四氮唑藍（NBT）染色,，37°C過夜,，拍照。
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