你知道PCR反應體系主要包含那些嗎,？讓我們一起來看看吧！
一,、模板（template)
模板即擴增用的DNA,，可以是任何來源DNA(如基因組DNA、質粒DNA等)或RNA（如總RNA,、mRNA,、tRNA、rRNA,、病毒RNA等）,，但必須符合兩個條件：一是純度必須較高，二是濃度不能太高以免抑制,。模板是待擴增的目的基因或特異片段,，如診斷病人是否攜帶有突變基因時，其模板就是提取的病人血液中的DNA或RNA片段,。PCR對模板DNA的純度不要求很高,，但應盡量不含有對PCR反應有抑制作用的雜質存在，如蛋白酶,、核酸酶,、Taq DNA聚合酶抑制劑、能與DNA結合的蛋白質,。
二,、引物（primers)
人工合成的一對引物可以分別與兩條模板DNA互補結合的寡核苷酸序列，其中一條稱為上游引物,，另一條稱為下游引物,。引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度,。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。引物濃度一般為0.1~0.5umol/L,，濃度過高會引起錯配和非特異擴增，濃度過低則得不到產物或產量過低,。引物長度一般為15~30bp,引物過長或過短都會降低特異性,。其3'末端一定要與模板DNA配對，末位堿基最好選用A,、C,、G(因T錯配也能引發(fā)鏈的延伸)。引物GC占45%~55%,，堿基應盡量隨機分布,，避免嘧啶或嘌呤堆積，兩引物之間不應有互補鏈存在,，不能與非目的擴增區(qū)有同源性,。
三、底物(dNTP)
dNTP包括dATP,、dTTP、dGTP,、dCTP,。dNTP溶液呈酸性，使用時應配成高濃度后,，以1mol/L NaOH或1mol/L Tris-HCl的緩沖液將其pH調節(jié)至7.0~7.5,，小量分裝，-20℃冰凍保存,。一般存儲濃度為10mo/L,，各成分以等當量配制，反應終濃度為20~200umol/L,，如其中任何一種濃度不同于其他幾種時（偏高或偏低）,，就會引起錯配。高濃度可加速反應,，但同時增加錯誤摻入和實驗成本,；低濃度可提高精確性，而反應速度會降低,。dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,，dNTP粉呈顆粒狀，如保存不當易變性失去生物學活性,。多次凍融會使dNTP降解,。dNTP能與Mg2+結合,，使游離的Mg2+濃度降低。當PCR需要較高濃度的dNTP時,，應在反應體系中適當增加Mg2+的濃度,。
四、DNA聚合酶
PCR所用的酶主要有Taq和Pfu兩種來源,，分別來自兩種不同的噬熱菌,。其中，Taq擴增效率高但易發(fā)生錯配：Pfu擴增效率弱但有糾錯功能,。所以,，實際使用時必須根據需要做不同的選擇。目前使用最多的是Taq酶,。該酶在92.5℃,、95.0℃和97.5℃時，其半衰期分別為130分鐘,、40分鐘和5~6分鐘,，可見該酶具有良好的熱穩(wěn)定性。Taq酶還具有良好的延伸效率,，其生物學活性在75~80℃時最高,，一般用72℃，每一個酶蛋白分子每秒可延伸約150個核苷酸,。在70℃時,，延伸速率為60個核苷酸/秒以上。當溫度超過80℃時,，該酶延伸速率明顯下降,，可能與引物—模板遭到破壞有關。其最適pH值為8.3~8.5,，能催化以DNA單鏈為模板,、以堿基互補原則為基礎、按5'→3'方向逐個將dNTP分子連接到引物的3'端,、合成一條與模板DNA互補的新的DNA子鏈,，無3'→5'的外切酶活性，沒有校正功能,。某種dNTP或Mg2+濃度過高,，會增加其錯配率。用量一般為0.5~5.0個單位/100uL,。
五,、PCR緩沖液(PCR buffer)
緩沖液的成分最為復雜，除水外一般包括四種有效成分：①緩沖體系,，一般使用HEPES或MOPS緩沖體系,；②一價陽離子,，一般采用鉀離子，但在特殊情況下也可使用銨根離子,；③二價陽離子,，即鎂離子，根據反應體系確定,，除特殊情況外不需調整,；④輔助成分，常見的有DMSO,、甘油等,，主要用來保持酶的活性和幫助DNA接觸纏繞結構。
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