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一,、免疫印跡膜的介紹

在Western blotting實驗中,，NC膜和PVDF膜是最chang用的兩種膜。NC膜是特異性轉(zhuǎn)移介質(zhì)之一,，使用范圍十分廣泛,，也是最早用于Western blotting實驗的膜。PVDF膜是在1985年開發(fā)出來的,，它能在比較苛刻的條件下(比如在酸性或堿性條件下,，或者在有機溶劑存在時)將蛋白保留，因此更廣泛用于Western blotting實驗中,。

二,、作用機理的介紹

1.  NC膜

NC膜與蛋白質(zhì)之間是依靠靜電作用和疏水作用相結(jié)合的，NC膜屬于親水膜,，使用前無需進行預(yù)活化,，使用方便、價格低廉,、對蛋白質(zhì)的活性影響小,、背景低；但其韌性較差，易損壞,，從而不能反復(fù)使用，如果在非離子型去污劑作用下,，結(jié)合上的蛋白比較容易被洗脫下來,。

2.  PVDF膜

PVDF膜與蛋白質(zhì)之間是依靠疏水作用相結(jié)合的，與NC膜相比,，PVDF膜有著ji好的化學(xué)穩(wěn)定性和更高的機械強度,，適合反復(fù)檢測（reprobing）和多次剝離（stripping）。PVDF膜需要先用甲醇潤濕后才能被常規(guī)的轉(zhuǎn)膜液所浸潤,，轉(zhuǎn)印緩沖液中添加的Ca2+離子能夠增強鈣調(diào)蛋白與Immobilon®-P轉(zhuǎn)印膜的結(jié)合,，鈣的結(jié)合使蛋白質(zhì)分子形成一個疏水袋結(jié)構(gòu)，從而增加蛋白與膜的結(jié)合,。此外,，PVDF膜具有更高的蛋白結(jié)合能力，一般NC膜的結(jié)合能力是80-100μg/cm2,，而PVDF膜可以達到150-160μg/cm2,。因此，PVDF膜已成為現(xiàn)階段實驗室WB的常用膜,。

三,、PVDF膜使用須知

1. PVDF膜為什么需預(yù)先活化？

PVDF膜本質(zhì)上是一種疏水性的聚合物,，不帶電荷并具有疏水性,，不能被常規(guī)轉(zhuǎn)膜液所浸潤，為了在水性緩沖液中使用,，需要在使用前進行預(yù)處理以浸潤和活化膜,。最chang用的方法是使用50%（v/v）或更高濃度的醇（甲醇、乙醇和異丙醇）溶液進行浸潤和活化,，使得PVDF膜中微孔內(nèi)的空氣能夠被低表面張力的甲醇所替代,，從而易于后續(xù)緩沖液進入PVDF膜中的微孔內(nèi)，使得PVDF膜從疏水性轉(zhuǎn)變?yōu)橛H水性,，在浸潤過程中膜的外觀會從不透明轉(zhuǎn)變?yōu)榘胪该?，此時表明PVDF膜已被wan全浸濕。然后用水反復(fù)沖洗以去除醇類,，再直接將膜放入轉(zhuǎn)印緩沖液中進行平衡,。膜被浸濕后，通過電轉(zhuǎn)移,，蛋白質(zhì)與膜接觸發(fā)生疏水作用而被吸附在PVDF膜上,。

2. PVDF膜孔徑對蛋白結(jié)合的影響？

膜孔徑越小,，膜對低分子量的蛋白結(jié)合就越牢固,。首先,，較小的孔徑會限制蛋白分子的運動，減緩其轉(zhuǎn)移速度,，蛋白與膜的結(jié)合就更充分,，從而更容易被攔截在孔道內(nèi)；其次,，較小的孔徑還能提供較大的膜表面積,，從而提高了蛋白與膜接觸的機會；此外,，較小的孔徑也能提供更高的表面密度,，從而增加了孔道與溶液間的分子間吸引力，這種吸附方式被稱為“毛細作用",。Schweitzer和Kriz在一項研究中發(fā)現(xiàn),，較小的孔徑可以增強其吸附能力并提供更高的蛋白密度，蛋白分子量越低,，蛋白的比表面積越大,，與膜接觸面越大越充分，結(jié)合就更緊密,。但是,，如果膜的孔徑小于0.1 μm，那么蛋白的轉(zhuǎn)移就很難進行下去了,，是因為蛋白質(zhì)分子的直徑大約在1-100 nm之間,。

3. 如何選擇PVDF膜？

一般情況下,，分子量大于20kD的蛋白應(yīng)選擇0.45μm的膜,，分子量小于20kD的蛋白應(yīng)選擇0.2μm的膜。0.2μm的PVDF膜內(nèi)部表面積大約是0.45μm的PVDF膜的三倍,，因此其吸附能力更高,。總之,，選擇PVDF膜的孔徑大小需要根據(jù)樣品蛋白的特性和大小來確定,，以期獲得最佳的結(jié)合效果。

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