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高效液相（HPLC）色譜柱五大誤解

閱讀：1172 發(fā)布時(shí)間：2022-7-26

使用填充較小顆粒的色譜柱,，總能獲得更高的效率

假,。盡管對于填充良好的色譜柱，隨著填充色譜柱中顆粒平均直徑的減小,，效率會提高,，但如果柱外對特定HPLC硬件系統(tǒng)的譜帶擴(kuò)寬的貢獻(xiàn)足夠高，則該色譜柱的全部性能將無法獲得被實(shí)現(xiàn),。柱外成分包括填料本身以外的所有其他體積,。這些貢獻(xiàn)包括以下內(nèi)容：

進(jìn)樣量包括回路尺寸以及進(jìn)樣閥內(nèi)的其他體積。
從進(jìn)樣器出口到色譜柱入口的油管容積。
保護(hù)柱間隙的體積,，包括端接頭（如果有）,。
在線過濾器體積（如果有）。
入口色譜柱接頭內(nèi)的內(nèi)部容積包括多孔篩板和流動通道,。
色譜柱的體積,。
底部色譜柱接頭內(nèi)的內(nèi)部容積包括多孔篩板和流動通道。
從色譜柱出口到檢測器入口的油管容積,。
流通池之前的檢測器內(nèi)的管道容積,。
流通池體積,。

所有這些體積的方差都是累加的,。因此，可以程度地減少進(jìn)樣量并使色譜柱入口管的長度短,，內(nèi)徑小,，但如果從色譜柱出口到檢測器的連接管有1 m，則譜帶展寬可能足夠大影響分離的整體效率,。因此,，如果您希望獲得1.8 μm HPLC色譜柱或內(nèi)徑為1.0 mm的色譜柱的預(yù)期效率，請確保將柱外效應(yīng)降至低,。

誤解2

對于硅膠填料,，殘留的硅烷醇導(dǎo)致拖尾峰

假。在某些情況下,，存在于所有基于硅膠的鍵合相色譜柱上的硅烷醇會引起拖尾,，特別是對于堿性化合物而言。這種拖尾歸因于硅烷醇基團(tuán)是一種弱酸,，pKa約為4.5-4.7,。因此，當(dāng)流動相的pH值接近4-5時(shí),，硅烷醇被離子化,，并可以通過靜電吸引作用與帶正電的分子（如質(zhì)子化的胺）相互作用。通過將pH值降至3以下來抑制硅烷醇的離子化,，可以大程度地減少這種相互作用,。對于某些堿性化合物，有時(shí)在較低的pH值下會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,。有專門設(shè)計(jì)的反相填料,，可以為堿性化合物提供良好的峰形。

峰拖尾的三個(gè)基本原因：化學(xué)問題（其中一個(gè)已在前面討論過）,；色譜柱填充問題和儀器硬件問題,。這三個(gè)因素都可能導(dǎo)致峰拖尾，并且必須調(diào)查根本原因以確定補(bǔ)救措施。詳細(xì)討論這三個(gè)問題不在此問題的范圍內(nèi),，但是每種類型的一些示例將為您提供總體思路,。首先，除了與硅烷醇的相互作用外,，與化學(xué)有關(guān)的拖尾問題還可以通過幾種方式表現(xiàn)出來,。金屬螯合化合物可與色譜柱填充物中的微量金屬發(fā)生相互作用，這對于較舊的二氧化硅材料尤為明顯,。使用錯(cuò)誤的注射溶劑有時(shí)會導(dǎo)致拖尾,。用比流動相強(qiáng)得多的溶劑注入樣品會產(chǎn)生峰形失真。拖尾可能是由于色譜柱頂部強(qiáng)烈保留的樣品組分或流動相雜質(zhì)造成的堆積材料引起的,。這種材料可以充當(dāng)不同的固定相,，從而導(dǎo)致相互作用的化合物出現(xiàn)拖尾問題。有時(shí)會出現(xiàn)混合模式,，從而導(dǎo)致拖尾,。在這里，溶質(zhì)可以通過反相和離子相互作用與活性基團(tuán)相互作用,。有時(shí),，當(dāng)流動相的pH值錯(cuò)誤并且樣品被部分電離時(shí)，所產(chǎn)生的峰可能會失真并且類似于拖尾,。較大峰背面的部分共溶峰較小,，有時(shí)看起來像拖尾。

色譜柱填充問題可能導(dǎo)致峰拖尾,。色譜柱頂部的空隙會導(dǎo)致雙峰或峰拖尾,。填料不充分的色譜柱可能會形成通道，導(dǎo)致峰形變差,。如果色譜柱因樣品質(zhì)量過大而超載,，則可能會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，盡管峰前沿更為普遍,。在低進(jìn)樣質(zhì)量下,，硅烷醇超載可能發(fā)生拖尾。

讓我們考慮一些可能會拖尾的儀器和硬件問題,。拖尾可能是由柱外效應(yīng)和流路中其他未清掃的體積引起的,。末端接頭或連接不正確造成的未清除體積可能會顯示為峰拖尾。來自進(jìn)樣器的壓力脈沖可能會導(dǎo)致色譜柱空隙,，從而導(dǎo)致拖尾,。緩慢的檢測器時(shí)間常數(shù)和快速洗脫的峰會導(dǎo)致峰展寬，有時(shí)類似于拖尾,。在室溫下進(jìn)入的溶劑與較高的色譜柱操作溫度之間的熱不匹配也會導(dǎo)致峰變形,。

因此,，并非總是硅烷醇在HPLC中引起峰拖尾。

誤解3

硅膠填料只能在pH2-7范圍內(nèi)使用

假,。通常,，HPLC反相色譜柱的化學(xué)降解機(jī)理有兩種：pH值小于2時(shí)硅氧烷鍵的催化水解；液相色譜法,。pH值大于7-8的氫氧根離子可溶解硅膠,。這兩種現(xiàn)象已由Kirkland及其同事進(jìn)行了廣泛研究。在pH值小于2時(shí),，–Si-O-Si-（硅氧烷）鍵可被氫鍵（H3O +）裂解鍵合相攻擊,，從而導(dǎo)致在有機(jī)的損失。隨著時(shí)間的流逝,，保留率通常會隨著碳含量的降低而降低,。對于短鏈封端部分，例如三甲基硅烷,，尤其值得注意,。較長的C18相由于其空間位阻而對下面的硅氧烷提供了一定的保護(hù),，但最終甚至?xí)艿角治g,，尤其是在溫度高于環(huán)境溫度的情況下。有空間保護(hù)和緊密覆蓋的鍵合相,，可幫助阻止鍵合相在硅膠上的裂解,。聚合物相沒有顯示出這種不穩(wěn)定性，但是具有比基于二氧化硅的相效率低的缺點(diǎn),。

在高pH值方面,，必須有某種方法來阻止下面的硅膠受到氫氧根離子的侵蝕。一旦發(fā)生溶解過程,，色譜柱最終將失效,，經(jīng)常會形成空隙。特殊色譜柱專為高pH操作而設(shè)計(jì),，包括二齒C18,，雜化和聚合物涂層二氧化硅。這些相從化學(xué)上保護(hù)基礎(chǔ)材料免受氫氧化物的侵蝕,。這些填料能夠承受11–12范圍內(nèi)的pH值,。在此范圍內(nèi)操作時(shí)，大多數(shù)二氧化硅基填料應(yīng)避免高溫,。當(dāng)然,，聚合物相可以在高達(dá)13的pH值下操作，有時(shí)甚至達(dá)到14,，但是,，它們的缺點(diǎn)是效率低于二氧化硅基相,。

因此，真正的答案是：特殊的硅膠鍵合相可以在pH值為2–7的區(qū)間之外操作,，但應(yīng)注意使用常規(guī)的硅膠填料,，尤其是在高溫下。

納譜分析

ChromCore系列液相色譜柱參數(shù)信息表

誤解4

現(xiàn)代HPLC色譜柱應(yīng)承受至少1000次進(jìn)樣

假,！有許多因素可控制任何現(xiàn)代HPLC色譜柱可以承受的進(jìn)樣次數(shù),。

一些因素基于模式：反相、離子交換,、體積排阻,、正相、手性,、親水性相互作用等,。

其中一些因素取決于色譜柱中填料的類型，例如硅膠填料,、雜化填料,、氧化鋯填料或聚合物填料，或軟凝膠或樹脂的交聯(lián)度,。

一些因素取決于鍵合相本身：覆蓋范圍,、鍵的類型、聚合物相,、單層或涂層相,。

其他因素取決于操作條件：pH、溫度,、流動相成分,、緩沖液組成、流速,、壓力等,。

還取決于所注入的樣品：僅標(biāo)準(zhǔn)樣品、樣品清潔度,、樣品pH值,、樣品體積、樣品中存在的雜質(zhì),、溶質(zhì)分子本身等,。

如果濫用色譜柱，例如在超出其建議的pH限制或流速范圍內(nèi)使用色譜柱,，則可能只會進(jìn)樣50次甚至更少,。如果樣品簡單，沒有高度保留的雜質(zhì),，則色譜柱可承受5000次或更多次進(jìn)樣,。如果色譜柱未在其上限處連續(xù)運(yùn)行,，則使用壽命會更長。如果色譜柱受到各種樣品的影響,，并且從未沖洗過以去除強(qiáng)烈保留的雜質(zhì),，那么它將縮短其壽命。

大多數(shù)人期望當(dāng)5 μm反相色譜柱用于分析配方,，簡單藥物混合物和標(biāo)準(zhǔn)品時(shí),，至少要進(jìn)樣1000次。如果該色譜柱用于“臟樣品",，例如尚未*清除的生物液體提取物或環(huán)境提取物,，則不應(yīng)期望進(jìn)行1000次進(jìn)樣。

因此,，預(yù)期的進(jìn)樣次數(shù)不是固定的,，而是取決于色譜柱的類型、操作條件,、樣品清潔度和濫用程度,。當(dāng)然，對于使用保護(hù)柱和在線過濾器,，色譜柱壽命應(yīng)更長,。許多色譜分析人員實(shí)際上并不知道每根色譜柱的使用壽命可獲得多少次進(jìn)樣。一些現(xiàn)代的HPLC儀器具有內(nèi)置的色譜柱模塊和軟件,，可以使它們監(jiān)測進(jìn)樣次數(shù),。

誤解5

色譜柱應(yīng)始終蓋緊,，以防止填料與大氣接觸

而損壞

假,！通常，端接件上的小孔的直徑可能不大于0.02英寸,，其橫截面面積很小,，以至于空氣進(jìn)入填料和溶劑內(nèi)部的溶劑接觸會損壞色譜柱。色譜柱蒸發(fā)極少,。即使有少量空氣進(jìn)入色譜柱,，也可能很難擴(kuò)散通過微粒填充床并與足夠的填充材料接觸，從而產(chǎn)生不利影響,。如果色譜柱中有少量空氣,，則在下次將其安裝到HPLC儀器中并對其進(jìn)行泵送流動相后立即對其加壓，則少量的空氣可能會在高壓下溶解或被沖洗掉,。初始液體在短時(shí)間內(nèi)不會對以后的使用造成任何問題,。但是，如果一定要通過封住端接裝置而感到更加安全,，那就這樣做,。大多數(shù)色譜柱配備了色譜柱接頭,，可以擰緊這些螺帽，以防止存儲溶劑蒸發(fā)或空氣進(jìn)入填充床的任何可能性,。

氣相色譜法測定水中乙腈

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