大鼠骨骼肌細(xì)胞模型

      骨骼肌細(xì)胞（Skeletal muscle cells）是人和動物體內(nèi)最大的細(xì)胞之一,，它們是由成肌細(xì)胞(Myoblasts)融合而來的多核細(xì)胞,，故骨骼肌的形成是一個非常復(fù)雜的過程,，并需要多種細(xì)胞信號通路的參與，包括phosphatidylinositol 3-kinase,，calcineurin，STAT3和MAPK等,。原代骨骼肌細(xì)胞的培養(yǎng)是研究細(xì)胞分化過程的有效的模型,。

骨骼肌細(xì)胞大鼠模型

動物品系：SD大鼠

實(shí)驗分組：正常對照組、模型組,、陽性藥組,、受試藥組低,、中、高三個劑量組

實(shí)驗周期：6~8weeks

建模方法：

1 . 組織取材   SD 大鼠yi醚吸入麻醉后腹腔內(nèi)注射氯an酮(22 mg/kg),。 以左側(cè)第 4 肋水平作橫切口, 取胸大肌約 1 cm3 , 并將其修剪成 1 mm3 大小的肌小粒 ,。反復(fù)用Hanks 液洗去血細(xì)胞 , 將肌小粒小心貼附于事先用明膠包被的細(xì)胞培養(yǎng)瓶底部 , 加入適量成肌細(xì)胞增殖培養(yǎng)液(Ham' s F-10 培養(yǎng)基中加入15 %小牛血清、青霉素100 U/ml ,、鏈霉素 100 U/ml),。將瓶底向上輕置于37℃、5 %CO2 ,、飽和濕度的培養(yǎng)箱中, 4 h 后輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶 , 使肌小粒浸浴于培養(yǎng)液中,。 3 d 換液一次 , 待細(xì)胞長滿瓶底即可傳代。

2 .成肌細(xì)胞的培養(yǎng) 采用組織塊培養(yǎng)法貼塊 2 d 后即可見有細(xì)胞從肌小粒邊緣爬出 , 細(xì)胞呈梭形, 胞漿透明,。1 周后細(xì)胞可長滿瓶底的 60 %～ 70 %, 其數(shù)目可達(dá) 105 , 此時細(xì)胞可呈多角形 , 充分伸展, 部分細(xì)胞密集區(qū)可見細(xì)胞呈向心性生長 , 相互間排列整齊 , 類似骨骼肌的縱切面,。

3 .成肌細(xì)胞的分化鑒定  將傳代后的細(xì)胞接種至 6 孔板, 加入增殖培養(yǎng)液 , 待細(xì)胞長至80 %滿時, 換入成肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化液(低糖DMEM培養(yǎng)基中加入 2 %馬血清、0 .5%雞胚提取物,、青霉0100 U/ml ,、鏈霉素 100 U/ml), 換用誘導(dǎo)分化液后細(xì)胞可在 3 d 內(nèi)分化 , 融合交織形成肌纖維, 可觀察到收縮現(xiàn)象;并且部分細(xì)胞分化形成細(xì)長的肌管, 高倍鏡下可見多個核及核分裂象。這些現(xiàn)象為成肌細(xì)胞所te有, 可以作為簡便的鑒定方法,。

4.成肌細(xì)胞的免疫熒光鑒定     

免疫熒光在培養(yǎng)板中將已爬好細(xì)胞的玻片用PBS浸洗3次,，每次3min；用4%的多聚甲醛固定爬片15min,， PBS浸洗玻片3次,，每次3min；0.5%Triton X-100( PBS配

制 )室溫通透20min,。PBS浸洗玻片3次,，每次3 min，吸水紙吸干PBS,，在玻片上滴加正常山羊血清,，室溫封閉30min。水紙吸掉封閉液,，不洗,，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗（Desmin結(jié)蛋白）并放入濕盒，4℃孵育過夜,；加熒光二抗：PBS浸洗爬片3次,，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗,，濕盒中20-37℃孵育1h,，PBST浸洗切片3次，每次3min。滴加DAPI避光孵育5min,，對標(biāo)本進(jìn)行染核,，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體,，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片,，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。