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2025 藥典重磅更新,！一文讀懂糖基化分析全流程與安捷倫黑科技
蛋白糖基化是一種主要的翻譯后修飾 (PTM),，糖鏈的分布和組成可影響療效和免疫原性。糖基化會受到許多不同因素的影響,，并會發(fā)生一定程度的異質(zhì)性,。因此，糖基化被認(rèn)為是必須控制以確保良好蛋白質(zhì)質(zhì)量的 CQA,。
2025 年版《中國藥典》III 部新增了糖蛋白的糖基化分析等 5 個指導(dǎo)原則以及修訂了包括N糖譜測定法等近 20 個通則,。這些新增指導(dǎo)原則與通則不斷提升標(biāo)準(zhǔn)的精確性與針對性，并補充了更精準(zhǔn)的測定方法與分析技術(shù),，有力地確保了產(chǎn)品的質(zhì)量和穩(wěn)定性,。
我們對糖基化分析指導(dǎo)原則（圖 1）和 N-糖譜測定法（表 1）更新總結(jié)如下：
表 1. 糖基化分析流程及方法
圖 1. N-糖譜分析通用方法
通過表 1，可以發(fā)現(xiàn)液相色譜/質(zhì)譜 (LC/MS) 系統(tǒng)已廣泛用于分析完整蛋白和亞基水平,，肽段水平,，以及表征 PTM。
安捷倫為糖基化提供完整糖蛋白,、糖肽,、寡糖、單糖的全面分析（圖 2）,。包括：
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前處理平臺
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Agilent 1290 Infinity III 液相色譜系統(tǒng)和 Agilent PLRP-S/AdvanceBio 專用色譜柱
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Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF 系統(tǒng)和/或熒光檢測器 (FLD)
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合規(guī)的數(shù)據(jù)處理軟件
圖 2. 安捷倫糖型/糖鏈表征工作流程
安捷倫 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF
在蛋白糖基化表征中的應(yīng)用案例分享
根據(jù)蛋白的復(fù)雜性,、與藥物安全有效的相關(guān)性以及生產(chǎn)監(jiān)控策略的總體設(shè)計等,，安捷倫對不同水平的主要工作流程進(jìn)行了相關(guān)研究。
Ⅰ.完整蛋白/亞基水平
在完整蛋白質(zhì)水平表征 mAb 糖型,，是快速評價和監(jiān)控 mAb 糖基化最為常用的方法,。以 NIST mAb 為例（圖 3），主要糖型均獲得了低至 ppm 級的誤差和出色的譜圖清晰度,，同時可獲得主要糖型修飾的相對比例。其他較小的糖基化異質(zhì)性（例如 GlcNAc 殘基缺失）,，也可輕松鑒定,。
圖 3. 完整 NISTmAb 的質(zhì)譜解卷積結(jié)果及主要糖型的相對定量（進(jìn)樣量 0.5µg）
rhEPO（重組人促紅細(xì)胞生成素）是一種活性糖蛋白。由于其糖基化位點多,，糖型結(jié)構(gòu)復(fù)雜,，一直被視為糖基化表征的難題。從圖 4 可以看出,，完整的 rhEPO 分子量分布在 30KDa 左右,，而其氨基酸序列的分子量僅不到 20KDa，因此糖含量高達(dá) 50% 以上,。
圖 4. 重組人促紅細(xì)胞生成素的質(zhì)譜解卷積結(jié)果
Ⅱ.亞基水平
使用 DTT 或 TECP,，對蛋白進(jìn)行還原，以便完全還原鏈間二硫鍵,。使用 IdeS 酶對蛋白酶切后再還原,，用 scFc 看糖型的類型和比例，亞基水平可以獲得比完整蛋白水平更豐富的糖型信息,，也可以用做亞基的 MAM,。
圖 5. Ideas 酶切 NIST mAb 還原后 scFc 解卷積結(jié)果
Ⅲ.糖肽水平
對于糖基化的位點研究，通常在肽段水平在進(jìn)行,。與 N-糖基化不同,，O-糖基化往往會在同一條肽段上出現(xiàn)多個修飾位點，此種情況下使用優(yōu)先斷裂糖苷鍵 CID（碰撞誘導(dǎo)碎裂）的碎片,，很難判斷修飾位點,。ECD（電子捕獲碎裂）碎裂技術(shù)是在 2015 年由 e-MSion 公司研發(fā)。該公司于 2023 年成為安捷倫的一分子,。ECD 碎裂時,，多電荷的肽段在碎裂時完整保留了糖苷鍵，碎裂效率高,，碎片信息豐富,，可以用于糖基化位點的修飾分析。使用 6545XT QTOF 的 ECD 技術(shù),，對融合蛋白依那西普（Enbrel）的 O-糖基化位點進(jìn)行了確認(rèn),，共鑒定到 12 個 O-糖基化位點，為 O-糖基化表征提供了技術(shù)依據(jù)（圖 6）。
圖 6. 依那西普肽段 SQHTQPTPEPSTAPSTSFLLPMGPSPPAEGSTGDEPK 第 4, 7, 11, 12, 15, 16 和 25 位的 S/T 7 個 Core1 糖基化修飾 ECD 碎片及位點修飾判斷的關(guān)鍵碎片 c2,c4,c8,c10,c11,c12,c15,c16,c17,c32 和 z7
Ⅳ.游離寡糖水平（以N-糖譜為例）
在游離寡糖水平可以獲得全面豐富的蛋白寡糖類型結(jié)構(gòu)和含量信息,。以游離N-糖分析為例,，通過 Gly-X InstantPC 試劑盒，可以在 45min 內(nèi)實現(xiàn)蛋白的酶切,、標(biāo)記到凈化,。經(jīng)過色譜分離后，進(jìn)行 LC-FLD/MS 的定量/定性分析（圖 7）,。配合 PCDL 數(shù)據(jù)庫,，可以覆蓋常見單抗和融合蛋白的 N-糖種類，使用方便,。
圖 7. InstantPC 標(biāo)記的西妥昔單抗 N-糖的 LC/FLD 色譜圖 (A),；根據(jù) MS 數(shù)據(jù)生成的提取化合物色譜圖表明熒光譜圖中有無法檢測到的聚糖峰 (B)
在游離寡糖水平的鑒別和定量工作中，含高唾液酸的糖蛋白藥物的寡糖結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜,，因此 2025 版《中國藥典》開發(fā)了針對的通用方法（圖 1）,。安捷倫基于此開發(fā)了一種含高唾液酸糖蛋白藥物的游離寡糖分析方法，使用陰離子交換色譜柱,，為這類分子的 N-糖定量提供可重現(xiàn)的高通量解決方案,。以康柏西普為例（圖 8），該方案穩(wěn)定可靠,，每個峰所帶的唾液酸數(shù)量均通過標(biāo)準(zhǔn)品定性,，并獲得良好分離。
圖 8. InstantPC 標(biāo)記的康柏西普樣品連續(xù)六次進(jìn)樣的疊加色譜圖
Ⅴ.游離單糖水平（以唾液酸為例）
唾液酸會影響蛋白藥物的半衰期和免疫原性,，因此有必要對糖蛋白中的唾液酸進(jìn)行測定,。色譜法可以實現(xiàn)不同種類唾液酸的分離，專屬性強,，且具有更高的靈敏度,，因此，2025 版《中國藥典》對唾液酸的色譜法進(jìn)行了補充,。安捷倫唾液酸分析與定量解決方案線性范圍寬,，定量限和檢測限結(jié)果良好，可用于糖蛋白中唾液酸的測定（圖 9）,。
圖 9. DMB 標(biāo)記的 (A) Neu5Ac 質(zhì)譜圖,；(B) Neu5Gc 質(zhì)譜圖；（C）西妥昔單抗的唾液酸 UHPLC 熒光譜圖,；（D）Neu5Ac 和 Neu5Gc 校準(zhǔn)曲線和 LOD 及 LOQ
安捷倫生物藥糖基化分析中的優(yōu)勢
總結(jié)如下：
快速,、完整的游離寡糖和單糖樣品前處理方案:
無需額外配備耗材,，可快速完成樣品前處理,。相比傳統(tǒng)的 2-AB 標(biāo)記,，專利的標(biāo)記試劑 InstantPC 熒光強度和質(zhì)譜響應(yīng)高 10 倍以上。
色譜分離：
1290 Infinity III Bio 超高效液相色譜儀系統(tǒng)采用生物兼容性流路,，減少了待分析物與管路表面的非特異性相互作用,。同時,，Infinity Lab Assist 技術(shù)可以使工作效率提升 > 20%。針對不同類型的糖蛋白糖基化分析特點,，專用的色譜柱確?？焖?、穩(wěn)定和可重現(xiàn)的色譜分離結(jié)果,。
高靈敏度 QTOF：
AJS 離子源幫助更好的聚焦離子,，提高離子化效率，從而提高質(zhì)譜檢測的靈敏度,。雙通道 ADC 檢測器保證了質(zhì)譜測量的質(zhì)量數(shù)和質(zhì)譜響應(yīng)的準(zhǔn)確度,。
BioConfirm的合規(guī)性軟件平臺：
專用 Fragile Swarm Tune 模式,，只需勾選糖譜 PCDL 庫和標(biāo)記物類型，即可進(jìn)行糖譜的匹配,。
參考文獻(xiàn)：
曹琰,，趙雄,，王曉娟等.2025 年版《中國藥典》三部增修訂概況[J].中國藥品標(biāo)準(zhǔn),2025,26(1): 28-33. doi: 10.19778/j.chp.2025.01.005