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淺析熒光素標記的生物素操作步驟
(一)獲得目的基因
1,、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設計一對引物(在上游和下游引物分別引入不同的酶切位點),，PCR循環(huán)獲得所需基因片段,。
2、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細胞或組織中提取總RNA,，以mRNA為模板,，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第一鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物,。
(二)構(gòu)建重組表達載體
1,、熒光素標記的生物素載體酶切：將表達質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶(同引物的酶切位點)進行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后,，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段,。
2、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收,，在T4DNA連接酶作用下連接入載體,。
(三)獲得含重組表達質(zhì)粒的表達菌種
1、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α,，根據(jù)重組載體的標志(抗Amp或藍白斑)作篩選,，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒,，雙酶切初步鑒定,。
2、測序驗證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,，進入下步操作,。否則應篩選更多克隆，重復亞克隆或亞克隆至不同酶切位點。
3,、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達宿主菌的感受態(tài)細胞,。
(四)誘導表達
1、熒光素標記的生物素挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB(含Amp50μg/ml)中37℃過夜培養(yǎng),。
2,、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0(*0.6,，大約需3hr)。
3,、取部分液體作為未誘導的對照組,，余下的加入IPTG誘導劑至終濃度0.4mM作為實驗組，兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr,。
4,、分別取菌體1ml，離心12000g×30s收獲沉淀,，用100μl1%SDS重懸,，混勻，70℃10min,。
5,、離心12000g×1min，取上清作為樣品,，可做SDS-PAGE等分析,。