目前有多種方法可以將基因?qū)胝婧思毎麅?nèi),，一般可分為病毒類載體技術(shù)和非病毒類載體技術(shù)，后者具有低毒性和低免疫反應的特點,，且不受細胞或種屬特異機制和導入片段大小等限制的優(yōu)勢,。其中，電穿孔法以其較高的轉(zhuǎn)染率而備受關(guān)注,。電穿孔法是應用短暫的高壓電流脈沖誘導活細胞產(chǎn)生跨膜電位,，由于外加電場強度大于細胞膜穿孔的臨界值，引起細胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)暫時性改變,，形成納米級微孔,，DNA等外源物質(zhì)通過這些微孔進入細胞質(zhì)或細胞核。

大多數(shù)細胞通過傳統(tǒng)轉(zhuǎn)染技術(shù)就可以提高轉(zhuǎn)染效率,，而原代細胞,、免疫細胞、神經(jīng)細胞,、干細胞等難以通過傳統(tǒng)方法獲得高轉(zhuǎn)染效率,，成為困擾科研人員的難題。NEPA GENE公司在細胞轉(zhuǎn)染和融合領(lǐng)域擁有超過二十年的研究經(jīng)驗，其代表產(chǎn)品NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)自上市以來受到了國內(nèi)外眾多科學家的青睞,。在干細胞轉(zhuǎn)染方面,，如iPS、ESC,、HSC和MSC等細胞,，NEPA21均被研究者們用于轉(zhuǎn)染實驗中，積累了豐富的轉(zhuǎn)染條件,、細胞轉(zhuǎn)染效率和基因編輯效率等寶貴的經(jīng)驗和數(shù)據(jù),。

案例一 使用NEPA21電轉(zhuǎn)染儀將mRNA導入hESC

參考文獻：Gene Manipulation of Human Embryonic Stem Cells by In Vitro-Synthesized mRNA for Gene Therapy

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：GFP / DsRed mRNA

電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓125V（文中只寫明電壓，詳細參數(shù)可咨詢）

在本研究中,，作者通過體外轉(zhuǎn)錄合成多種類型的mRNA,，使用NEPA21電轉(zhuǎn)儀將其導入到hESC中，以研究mRNA在hESC中的轉(zhuǎn)染效率和誘導蛋白表達的時間（圖1）,。同時,，為了保證轉(zhuǎn)染效率對HN4細胞系不具有特異性，作者對多種hESC細胞系和iPS的轉(zhuǎn)染效率進行了比較,。在電穿孔24h后,，F(xiàn)CAS分析顯示，GFP mRNA在HN4,、NS1,、NS2和iPS中表達量均在95%以上（圖1）。

圖1 電穿孔24h后,，GFP在不同細胞系中的轉(zhuǎn)染效率

在電穿孔后,，是否能維持胚胎干細胞的多能性仍需要進一步的檢測。在此,，研究人員通過免疫熒光法檢測了兩種常見的標志基因（Oct4和SSEA4）。結(jié)果顯示,，轉(zhuǎn)染24h后,，大多數(shù)表達GFP的細胞仍然呈Oct4陽性和SSEA4陽性。

圖2 電穿孔24h后,，HN4細胞中Oct4和SSEA4基因的表達

此外,，研究人員還證明采用電穿孔法可以有效地將GFP和DsRed mRNA共轉(zhuǎn)染至HN4細胞中（圖3）。

圖2 GFP和DsRed mRNA共轉(zhuǎn)染

案例二  使用NEPA21進行iPSC電轉(zhuǎn)及基因編輯（CRSIPR/TALENs）

參考文獻：

1.Precise correction of the dystrophin gene in duchenne muscular dystrophy patient induced pluripotent stem cells by TALEN and CRISPR-Cas9.

2. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR–Cas9 system

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：EGFP質(zhì)粒,、敲除實驗（TALENs: 5μg left + 5μg right或CRISPR: 5μg Cas9 + 5μg sgRNA）,、敲入實驗（5μg donor vector + TALENs（5μg left + 5μg right）或CRISPR（5μg Cas9 + 5μg sgRNA））

電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓125V、脈沖時長5ms,、脈沖次數(shù)2

為了在iPS細胞中獲得最高的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率,，研究人員使用EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染了3種iPS細胞系（201B7、404C2、DMD-iPSC）,，優(yōu)化脈沖電壓,、脈沖時間等轉(zhuǎn)染條件。結(jié)果如下圖所示：

圖4 iPSC轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化

使用NEPA21優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件之后,，通過TALEN和CRISPR兩種方法對iPSC的DMD基因進行敲除和敲入實驗,，基因編輯效率如下：

Knockout：

圖5 iPSC基因敲除效率

Knockin：

圖6 iPSC基因敲入效率

案例三  使用NEPA21進行HSC轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化及基因編輯（CRISPR）

參考文獻：Non-viral ex vivo genome-editing in mouse bona fide hematopoietic stem cells with CRISPR/Cas9

轉(zhuǎn)染質(zhì)粒：CRISPR/RNP

電轉(zhuǎn)參數(shù)：穿孔參數(shù)（電壓100V、脈沖時長5ms,、脈沖次數(shù)8）,、轉(zhuǎn)移參數(shù)（電壓10V、脈沖時長50ms,、脈沖次數(shù)5）,，本文使用1mm間隔電轉(zhuǎn)杯

在這項研究中，研究者旨在通過連續(xù)移植來評估真正的HSCs的基因組編輯效率,。為了避免病毒整合到HSC基因組中,，采用了非病毒轉(zhuǎn)染方法（電穿孔）來編輯小鼠HSC的基因組。首先通過電穿孔將Cas9/RNP轉(zhuǎn)移到體外的HSC中,，隨后通過三次細胞移植來檢驗真正的HSC的敲除效率,。此外，通過基因插入,，還成功地證明了對小鼠HSCs中X-SCID突變的基因校正,，從而治愈了小鼠。

研究人員首先以GFP為報告基因,，通過NEPA21在小鼠骨髓系陰性細胞（Lin^-）中優(yōu)化了電穿孔條件,，并通過GFP熒光和7-氨基-放線jun素D（7-AAD）染色檢測細胞轉(zhuǎn)染效率和細胞存活率。結(jié)果顯示,，在電壓100V,、脈沖時間5ms、脈沖次數(shù)8次的電轉(zhuǎn)條件下,，細胞轉(zhuǎn)染效率>60%,，存活率>50%，可作為后續(xù)實驗的電穿孔參數(shù)（圖7）,。

圖7 HSC轉(zhuǎn)染效率

隨后,，將針對Itga2b基因外顯子1和2的RNP復合體電穿孔轉(zhuǎn)染至Lin^-細胞。在體外培養(yǎng)1~2周后,，通過Surveyor實驗檢測到Itga2b外顯子1和2的突變,，并且將基因編輯后的Lin^-細胞通過連續(xù)移植后仍能檢測到15%定點突變效率，證明了基因編輯發(fā)生在真正的HSC中（圖8）,。

圖8 在HSC中敲除Itga2b結(jié)果

為了恢復X-SCID小鼠的IL2RG基因功能,，研究者采取了基于NHEJ和同源無關(guān)的靶向整合（HITI）的策略,，將IL2RG外顯子2-8（HITI-cDNAex2-8）整合到IL2RG的內(nèi)含子1。他們先在NIH3T3細胞中測試了該方法,，通過NEPA21電轉(zhuǎn)儀導入IL2RG內(nèi)含子1的gRNA與Cas9（Cas9/RNP-Il2rgin1）,，在NIH 3T3細胞中有效地產(chǎn)生了43.1%的突變。基于此,，進一步檢測了在Lin^-細胞中的基因插入效率,，通過Surveyor分析和擴增序列測定，細胞基因突變效率為20.2%（圖9）,。

圖9 在HSC中對IL2RG基因插入結(jié)果

本文中提到,，Cas9/RNP通過電穿孔到造血干細胞，可以不使用任何病毒載體,，基因編輯技術(shù)為基因位點的特異性修飾提供了可能,。非整合病毒如腺病毒或腺相關(guān)病毒（AAV）經(jīng)常被用來傳遞CRISPR/Cas9，但它們會在宿主中激發(fā)對組成性表達的Cas9的免疫反應,。相反,，Cas9/RNP在轉(zhuǎn)導細胞中迅速降解，從而逃避宿主的免疫反應,，更重要的是,，電穿孔與其他傳遞方法相比，產(chǎn)生的脫靶DSB更少,。

案例四  使用NEPA21電轉(zhuǎn)MSC的最佳條件

參考文獻：電穿孔法轉(zhuǎn)染臍帶華通膠間充質(zhì)干細胞的最佳條件

轉(zhuǎn)染物質(zhì)：EEV-EGFP質(zhì)粒

電轉(zhuǎn)參數(shù)：電壓150V,、脈沖時長5ms、脈沖間隔50ms,、脈沖次數(shù)2

本文采用電穿孔法將質(zhì)粒EEV-EGFP轉(zhuǎn)入華通膠間充質(zhì)干細胞（WJ-MSC）,，并通過流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染率，以探討不同電穿孔條件對WJ-MSC轉(zhuǎn)染效率的影響,，確定最佳電轉(zhuǎn)染條件,。

研究人員測試了不同電壓（125，130,，140,，150，170V）,、不同脈沖時間（2.5，5.0,，7.5ms）,、不同細胞狀態(tài)（體積分數(shù)為20%正常氧、體積分數(shù)為5%低氧）對WJ-MSC電轉(zhuǎn)染效率的影響,。電穿孔后48h進行檢測,，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒攜帶EGFP綠色熒光標簽，轉(zhuǎn)染成功的WJ-MSC將表達綠色熒光蛋白，使用流式細胞儀檢測熒光表達率,。

結(jié)果表明,，正常培養(yǎng)的WJ-MSC在電壓150V、脈沖時長5.0ms,、脈沖間隔時間50ms,、脈沖數(shù)2次時可達到較高的電轉(zhuǎn)染率。

圖10 不同轉(zhuǎn)染條件下WJ-MSC的轉(zhuǎn)染效率

總結(jié)

較高的電穿孔條件可以更有效地編輯基因組,，但會對細胞造成較大損傷,，而較弱的電轉(zhuǎn)染條件對細胞更溫和，但細胞轉(zhuǎn)染效率和編輯效率可能較低,。因此,，為基因組編輯效率和細胞活力找到一個可接受的條件是十分重要的。NEPA21采用全新四步法電轉(zhuǎn)程序,，可對細胞穿孔模式和基因轉(zhuǎn)移模式中的所有參數(shù)進行單獨設(shè)置（電壓,、脈沖時長、脈沖間隔,、脈沖次數(shù)和衰減比例）,，非常有利于難轉(zhuǎn)染細胞的參數(shù)優(yōu)化，提高轉(zhuǎn)染效率,。

NEPA21高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)采用全新設(shè)計的電轉(zhuǎn)程序,，配合電壓衰減設(shè)計，在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時,，提高細胞存活率,。操作簡單，電轉(zhuǎn)參數(shù)可見可調(diào),，適用性強,。特別適用于難轉(zhuǎn)染的原代免疫細胞、干細胞,、神經(jīng)細胞,、外泌體、類器官,、活體動物,、受精卵及宮內(nèi)胚胎等的轉(zhuǎn)染，已應用于眾多著名期刊文獻中,，是進行細胞懸浮/貼壁狀態(tài),、活體和離體組織轉(zhuǎn)染的電轉(zhuǎn)系統(tǒng)主流品牌之一。

本文引用的案例均為已發(fā)表文獻,，想了解NEPA21更多應用案例或?qū)嶒灱毠?jié)可咨詢,。

END

廣州市艾貝泰生物科技有限公司立足于生物工藝的優(yōu)化,、放大及生產(chǎn)，除了為國內(nèi)客戶提供高品質(zhì)的Applikon生物反應器,，還引進了先進產(chǎn)品,，如NEPA21 高效基因轉(zhuǎn)染系統(tǒng)、Nova生化分析儀,、Cytena克隆篩選單細胞打印機系統(tǒng),、Kaiser拉曼在線生物工藝分析儀、Flownamics在線取樣器,、ConstantSystems高壓細胞破碎儀等,。為滿足生物制藥行業(yè)高速發(fā)展的需要，艾貝泰也專業(yè)研發(fā)和生產(chǎn)一次性使用的生物工藝設(shè)備和耗材,，現(xiàn)可提供取樣,、補料、儲液,、配液過程中所需的無菌袋以及攪拌,、稱重系統(tǒng)等，同時提供定制化服務(wù),，力求幫助客戶優(yōu)化培養(yǎng)工藝,、降低研發(fā)成本、更快通過相關(guān)驗證,。艾貝泰不斷完善生物制藥領(lǐng)域的產(chǎn)品線,，為用戶提供詳細的專業(yè)產(chǎn)品解決方案。

掃碼關(guān)注我們 了解更多相關(guān)資訊