Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins

利用Cas9核糖核酸蛋白在工業(yè)微藻中實現(xiàn)高效無轉(zhuǎn)基因靶向誘變和單鏈寡脫氧核苷酸介導(dǎo)的精確敲入

2019 年 5 月 26 日,，在Plant Biotechnology Journal 雜志發(fā)表了一篇論文" Highly efficient transgene-free targeted mutagenesis and single-stranded oligodeoxynucleotide-mediated precise knock-in in the industrial microalga Euglena gracilis using Cas9 ribonucleoproteins  ",，文章中將CRISPR/ Cas9系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)應(yīng)用于纖細裸藻中，為闡明其他微藻類的基因功能提供了一個突破,。

纖細裸藻是一種單細胞光合鞭毛蟲,，也是一種工業(yè)開發(fā)的微藻，它富含營養(yǎng)元素,，積累大量的裸藻淀粉,，具有多種生物活性功能。因此,，大量培養(yǎng)的纖細裸藻是功能性食品,、飼料和化妝品的商業(yè)來源。此外，在厭氧條件下,，裸藻淀粉可被降解并轉(zhuǎn)化為主要由肉豆蔻酸和肉豆蔻醇組成的蠟酯,。由于纖細裸藻產(chǎn)生的蠟酯很容易轉(zhuǎn)化為具有低冰點的生物燃料，因此它適合作為生物噴氣燃料的來源,。

纖細裸藻（又名小眼蟲,，Euglena  gracils）

在文章中，研究者為了在纖細裸藻中建立了一種基于Cas9核糖核酸蛋白（RNPs）的無轉(zhuǎn)基因誘變方法,，在纖細裸藻葡聚糖合成酶2（EgGSL2）基因的第二個外顯子內(nèi)設(shè)計了兩個靶序列,，他們推測該基因可能參與了裸藻淀粉的生物合成。使用NEPA GENE電轉(zhuǎn)儀將Cas9核糖核酸蛋白導(dǎo)入到纖細裸藻細胞中（圖1b）,。實驗結(jié)果表明,，這兩種以EgGSL2為靶點的RNPs可以使纖細裸藻細胞表現(xiàn)出更少但更大的裸澡淀粉顆粒。靶1和靶2表型改變的平均頻率分別為71.3%和80.6%(圖1d),，并且在電穿孔后72h檢測,，插入缺失突變率分別為77.7-86.8%和88.8-90.1%（圖1g）。

纖細裸藻作為一種可再生資源具有很多優(yōu)異特性,，但想要建立其有效靶向誘變一直是一個長期的挑戰(zhàn),。在這里，研究者利用CAS9 RNPS開發(fā)了一種高效的無轉(zhuǎn)基因靶向誘變和單鏈寡核苷酸介導(dǎo)的基因敲入,，這將為纖細裸藻是一種可編輯基因組的有機體提供了第一個證據(jù),，利用裸藻中所含的副淀粉和脂肪酸合成了生物塑料，為纖細裸藻開發(fā)應(yīng)用開拓了新方向,，同時促進生物材料生產(chǎn)的可持續(xù)性發(fā)展,。

文章采用的是NEPA21 電轉(zhuǎn)染儀來進行電轉(zhuǎn)，采用全新的四步法電轉(zhuǎn)程序,，配合多脈沖,、電壓衰減（Voltage Decay）和輔助基因?qū)肽Ｊ皆O(shè)計，可在獲得高轉(zhuǎn)染效率的同時,，提高細胞存活率 ,，并且不需要特殊轉(zhuǎn)染試劑輔助。