數(shù)字PCR技術(shù)的原理
數(shù)字PCR（DigitalPCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測和定量方法,，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同,，數(shù)字PCR采用定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本,，直接檢測目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性,、精確性,，dPCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項技術(shù)在極微量核酸樣本檢測,、復(fù)雜背景下稀有突變檢測和表達量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢已被普遍認可,，而其在基因表達研究、microRNA研究,、基因組拷貝數(shù)鑒定,、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測、致病微生物鑒定,、轉(zhuǎn)基因成分鑒定,、NGS測序文庫精確定量和結(jié)果驗證等諸多方面具有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。
數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡單,，就是“分而治之”（divideandconquer）,，這種做法非常類似于計算機科學(xué)中的“分治算法”，將一個標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中,，在每個反應(yīng)器中包含或不包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子(DNA模板),，實現(xiàn)“單分子模板PCR擴增”，擴增結(jié)束后,，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù),。在實際的數(shù)字PCR實驗中，事實上是通過呈現(xiàn)兩種信號類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進行統(tǒng)計學(xué)分析,，計算出原始樣本中的模板拷貝數(shù),。
數(shù)字PCR可以直接計算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以進行精確的定量檢測,；此外,，由于數(shù)字PCR在進行結(jié)果判讀時僅判斷有/無兩種擴增狀態(tài)，因此也不需要檢測熒光信號與設(shè)定閾值線的交點,，*不依賴于Ct值的鑒定,，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴增效率的影響大大降低，對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高,；數(shù)字PCR實驗中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度,，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測稀有突變。
數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展歷史
從以上介紹我們可以看到，事實上數(shù)字PCR與傳統(tǒng)的定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺基礎(chǔ)——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和雙鏈DNA標(biāo)記技術(shù),，但兩者采用的是*不同的定量策略和思想方法,，dPCR和qPCR并沒有實驗方法和思路上的承繼關(guān)系，從這個角度來說,，目前很多人把數(shù)字PCR稱為第三代PCR技術(shù)并不準(zhǔn)確,。
在實時定量PCR技術(shù)成熟和發(fā)展之前，早在1992年,，南澳洲弗林德斯醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家使用有限稀釋,、PCR和泊松分布數(shù)據(jù)校正模型的方法（limitingdilution,PCRandPoissonstatistics），檢測了復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因,，進行了極其精細的定量研究,，雖然當(dāng)時這種方法并沒有被冠以“數(shù)字PCR”之名，但已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實驗流程,，更重要的是了數(shù)字PCR檢測中一個極其重要的原則——以“終點信號的有或無”（all-or-noneendpoint）作為判斷標(biāo)志,，這也是之后1999年BertVogelstein和KenKinzler將之命名為“數(shù)字PCR”(digitalPCR)的主要原因。
數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡單,，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸,。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads,Emulsion,Amplification,Magnetics),，2006年Fluidigm公司推出了臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng),。2008年德國Inostics推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMingdPCR檢測服務(wù)，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達到更加精細的要求,，時間和耗材成本嚴重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展,。
近幾年來，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabricationandmicrofluidics）的發(fā)展,，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的佳契機,。1997年Kalinina,、BrownJ,和SilverJ使用納升級芯片進行單克隆模板PCR擴增,，獲得了美國,，更重要的是這種采用“電浸潤法”進行納升級芯片制造技術(shù)顯露雛形。伴隨二代測序技術(shù)發(fā)展起來的“油包水PCR”技術(shù),，可以一次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個納升甚至皮升級別的單個油包水微滴,，可以作為dPCR的樣品分散載體。
QuantaLife利用油包水微滴生成技術(shù)開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù),，這也是早出現(xiàn)的相對成熟的數(shù)字PCR平臺,，在運行成本和實驗結(jié)果穩(wěn)定性方面都基本達到了商品化的標(biāo)準(zhǔn)。2011年,，QuantaLife公司被Bio-Rad公司收購,，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號儀繼續(xù)在市場上銷售,，這個早期型號為dPCR概念的普及和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級型號QX200,。
2012年,，RainDance公司推出Raindrop型號數(shù)字PCR設(shè)備，這個設(shè)備將其原有的二代測序文庫制備平臺技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺,，在高壓氣體驅(qū)動下,，將每個標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬至1000萬個皮升級別微滴的反應(yīng)乳液，該公司的創(chuàng)始人之一DarrenLink表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測動態(tài)范圍,，適用于處理更大濃度差異的不同樣品”,。
2013年下半年,，Life-technologies推出了QuantStudio3D數(shù)字PCR系統(tǒng),，這也是目前數(shù)字PCR市場上型號的產(chǎn)品,。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20,000個單獨的反應(yīng)孔中,。在整個工作流程中，樣本之間保持*隔離,，可以有效地防止樣品交叉污染,，減少移液過程，簡化操作步驟,。同時芯片式設(shè)計避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題,。
作為Life-technologies在OpenArray芯片平臺之外推出的全新的芯片式數(shù)字PCR系統(tǒng)，值得一提的是,，這個全新的系統(tǒng)在設(shè)計理念上綜合考慮了系統(tǒng)穩(wěn)定性與運行成本因素,，直接反映了該系統(tǒng)“適合所有分子生物學(xué)實驗室使用的數(shù)字PCR系統(tǒng)”的市場定位。
數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域
從上世紀(jì)90年代以來qPCR技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測技術(shù)具有全新的面貌,，而進入二十一世紀(jì)之后,，速度更快、通量更高,。成本更低的DNA測序技術(shù)正在迅速發(fā)展,，也是目前競爭為激烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下,，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭取到屬于自己的一席之地,。即使在一些傳統(tǒng)的qPCR應(yīng)用領(lǐng)域，也有一些實驗室同時選擇dPCR平臺進行平行實驗以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確和可重復(fù)性,。
在基因組變異研究領(lǐng)域,，群體基因組水平上的SNP（SingleNucleotidePolymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時存在,，競爭性反應(yīng)嚴重影響突變序列的檢測精度,，數(shù)字PCR技術(shù)帶來的*的擴增特異性在稀有突變檢測方面具有天然的優(yōu)勢,，在癌癥標(biāo)志物檢測、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查,、線粒體突變檢測等研究方向上,，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。
CNV（CopyNumberVariations,，拷貝數(shù)變異）研究需要*的定量精度以區(qū)別不同拷貝數(shù)之間的微小差異,，測序方法適用于高于30%的變異率檢測，而qPCR的分辨在1.5倍左右,，數(shù)字PCR通過直接計數(shù)目標(biāo)基因與參照基因(拷貝數(shù)為1的基因,，例如RNaseP)的數(shù)目，計算比值,，直接得到目標(biāo)基因的拷貝數(shù)可以達到*的拷貝數(shù)分辨精度,。
除此之外，dPCR在病原微生物檢測,、microRNA研究,、基因表達研究、NGS測序文庫的定量,、表觀遺傳學(xué)直接相關(guān)的DNA甲基化定量檢測,、ChIP定量鑒定等領(lǐng)域的應(yīng)用都令人極為期待，而在轉(zhuǎn)基因成分鑒定,、分子標(biāo)準(zhǔn)品精確定量,、環(huán)境樣本檢測等具體的應(yīng)用方向上，已經(jīng)有大量實驗數(shù)據(jù)和結(jié)果證明了dPCR技術(shù)的優(yōu)良性能,。
與傳統(tǒng)qPCR技術(shù)相比,，數(shù)字PCR技術(shù)具有*的靈敏度、特異性和精確性,，但截止目前而言,，數(shù)字PCR對廣大科研工作者仍然是一種全新的檢測方法，我們在看待數(shù)字PCR的應(yīng)用前景時,，更應(yīng)該保持一種開放的心態(tài),，與其說數(shù)字PCR技術(shù)是一個新的檢測平臺，不如把它視為一種全新的技術(shù)思路和手段,，在這個平臺上必將有更多的應(yīng)用幫助我們深入到分子生物學(xué)研究的更高層次,。
