GST Pull down實驗技術

1. 實驗原理

Pull down技術是將"誘餌"蛋白與一種易于純化的配體標簽（如：GST標簽、His標簽）進行融合表達,，而帶標簽的誘餌蛋白能被特異結合該標簽的固相親和配基捕獲,，形成"次級親和支持物",，用于純化與誘餌蛋白相互作用的其他蛋白,。純化產(chǎn)物洗脫后,，經(jīng)Western blot驗證或LC-MS/MS,，即鑒定與誘餌蛋白互作的蛋白,。1988年Smith等利用谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）融合標簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白。從此,，GST融合蛋白在蛋白質相互作用研究領域里得到了極大的推廣,。GST融合蛋白在經(jīng)過固定有谷胱甘肽（GSH）的色譜柱時，就可以通過GST與GSH的相互作用而被吸附,。當再有細胞抽提物過柱,，就可以得到能夠與“誘餌"蛋白相互作用的興趣蛋白。GST pull down是一種體外驗證或篩選互作蛋白的技術,。

2. 實驗流程

1. 構建帶標簽的誘餌蛋白原核表達載體（帶GST標簽或His或）,；

2. 載體轉化大腸桿菌,，表達誘餌蛋白（關鍵步驟，很多蛋白原核表達時會形成包涵體,，極大地影響后續(xù)實驗,。我們采用自誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)細菌，能有效降低包涵體的形成）,；

3. 細菌裂解液過柱子,，帶標簽的誘餌蛋白被特異結合標簽的固相化親和配基捕獲，產(chǎn)生"次級親和支持物",；

4. 待測樣品裂解液過柱子孵育,，與誘餌蛋白互作的蛋白被“次級親和支持物"吸附；

5. 清洗,，離心,，去除未結合的雜蛋白；

6. 洗脫,，得到誘餌蛋白及其互作蛋白的復合物,；

7. 如要驗證某個蛋白X與誘餌蛋白互作，則將6.所得的蛋白復合物與X蛋白的抗體孵育,，做Western blot驗證,；

8. 如要尋找誘餌蛋白可能的互作蛋白，則將6.所得的蛋白復合物進行LC-MS/MS鑒定,。

3. 技術服務

1. 原核表達載體構建,；

2. 融合蛋白的誘導表達和純化；

3. pull down捕獲互作蛋白,；

4. Western blot驗證（兩種目標蛋白互作/兩種蛋白互作的結構域）；

5. LC-MS/MS鑒定可能的互作蛋白,。

4. 交付結果

1. 客觀公正的實驗原始數(shù)據(jù)和分析結果,；

2. 提供詳細、完整的實驗報告,。

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