您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
細(xì)胞凍存操作方法與注意事項(xiàng)
閱讀：1036 發(fā)布時(shí)間：2022-12-9
我們經(jīng)常遇到過這個(gè)問題：自己養(yǎng)的細(xì)胞開始長(zhǎng)的還挺好的,，可是凍存之后復(fù)蘇會(huì)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)不好甚至復(fù)蘇不起來,。出現(xiàn)這種問題很有可能就是你的凍存環(huán)節(jié)出了問題。
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下時(shí),，細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶,，冰晶的大小對(duì)細(xì)胞有影響是不同的，大冰晶容易造成細(xì)胞膜,、細(xì)胞器的損傷和破裂,，因此就會(huì)造成我們復(fù)蘇出來的細(xì)胞存活率、狀態(tài)等與凍存前的狀態(tài)相差甚遠(yuǎn)。那么我們要怎么解決這些問題呢,？
首先我們?cè)趦龃娴倪^程中要減少冰晶的形成,，尤其是大冰晶的形成：緩慢凍存細(xì)胞，可使細(xì)胞內(nèi)避免產(chǎn)生大的冰晶,。
那么我們?cè)撛鯓觾龃婕?xì)胞呢,？
一、慢凍細(xì)胞
1,、常規(guī)程序：
使用程序降溫盒
當(dāng)溫度在-25℃以上時(shí),，1-2℃/min。
當(dāng)溫度在-25℃以下時(shí),，5-10℃/min,。
當(dāng)溫度達(dá)到-100℃時(shí)，可迅速轉(zhuǎn)入液氮中,。
2,、簡(jiǎn)易程序：
冷凍管管口朝上，放入紗布袋內(nèi),，紗布袋系以線繩,，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘下降1-2℃的速度,，在40min內(nèi)降至液氮表面過夜,，次晨投入液氮中。
3,、傳統(tǒng)程序：
冷凍管置于4℃10min,，-20℃30min，-80℃16-18h（或隔夜）,，液氮長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。
二、低溫保護(hù)劑
常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,，它是一種滲透保護(hù)劑,，可迅速透入細(xì)胞，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,，降低冰點(diǎn),，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外,，在胞外形成冰晶,，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷,。
三,、細(xì)胞凍存方法
1,、預(yù)先配制凍存液：
凍存液比例多種，根據(jù)細(xì)胞的特性進(jìn)行調(diào)整凍存液的比例：
5%—10%DMSO+20%—90%血清+0%—70%基礎(chǔ)培養(yǎng)液,；
2,、取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液,，用PBS清洗1-2次,；去掉培養(yǎng)瓶里的殘余血清；
3,、加入適量胰酶（濃度一般為0.25%）,，使胰酶覆蓋整個(gè)瓶，放入培養(yǎng)箱消化,；
4,、細(xì)胞消化0.5-2min（具體時(shí)間根據(jù)鏡下形態(tài)判斷），顯微鏡下觀察細(xì)胞,，細(xì)胞胞質(zhì)回縮,，細(xì)胞間不再連接成片，此時(shí)加入培養(yǎng)基終止消化,；
5,、用巴氏吸管輕輕吹打細(xì)胞，形成細(xì)胞懸液,，將細(xì)胞懸液1000r/min左右條件下離心3-5min,；
6、棄上清,，加入適量預(yù)先配制好的凍存液,，巴氏吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù),，調(diào)節(jié)凍存液中的細(xì)胞最終密度為5×106/ml～1×107/ml,；
7、將細(xì)胞分裝入凍存管中,，每管1-1.5ml,；
8、凍存管標(biāo)記細(xì)胞名稱,，凍存時(shí)間,，操作者及細(xì)胞代數(shù)信息,。
對(duì)于懸浮細(xì)胞凍存,，則直接收集離心細(xì)胞，除去胰酶消化的步驟,，其他步驟相同,。
注意事項(xiàng)
1,、需凍存保種的細(xì)胞應(yīng)在生長(zhǎng)良好且存活率高，其密度約為80-90％的狀態(tài),。細(xì)胞凍存前應(yīng)保證細(xì)胞的活力好,，無污染。
2,、在細(xì)胞凍存過程中,，所結(jié)的冰晶對(duì)細(xì)胞傷害較大，所以過程一定要慢,。凍存或者復(fù)蘇最好用新配制的培養(yǎng)液,。