您好, 歡迎來到化工儀器網(wǎng)
細胞凍存及復蘇的小知識
閱讀：2274 發(fā)布時間：2021-9-6
細胞凍存是細胞保存的主要方法之一,。在低于-70°C的超低溫條件下，有機體細胞內(nèi)部的生化反應極其緩慢，甚至終止。利用凍存技術將細胞置于-196℃液氮中低溫保存，可以使細胞暫時脫離生長狀態(tài)而將其細胞特性保存起來,，這樣在需要的時候再復蘇細胞用于實驗。而且適度地保存一定量的細胞,，可以防止因正在培養(yǎng)的細胞被污染或其他意外事件而使細胞丟種,，起到了細胞保種的作用。
影響細胞凍存的因素：
冷凍保護劑：如果將細胞懸浮在純水中,，隨著溫度的降低,，細胞內(nèi)外的水分都會結冰，所形成的冰晶會造成細胞膜和細胞器的破壞而引起細胞死亡,。這種因細胞內(nèi)部結冰而導致的細胞損傷稱為細胞內(nèi)冰晶的損傷,。如果將細胞懸浮在溶液中，隨著溫度的降低,，細胞外部的水分會首先結冰,，從而使得未結冰的溶液中電解質(zhì)濃度升高。如果將細胞暴露在這樣高溶質(zhì)的溶液中且時間過長,，細胞膜上脂質(zhì)分子會受到損壞,，細胞便發(fā)生滲漏，在復蘇時,，大量水分會因此進入細胞內(nèi),，造成細胞死亡。這種因保存溶液中溶質(zhì)濃度升高而導致的細胞損傷稱為溶質(zhì)損傷或稱溶液損傷,。當溫度進一步下降,，細胞內(nèi)外都結冰，產(chǎn)生冰晶損傷,。但是如果在溶液中加入冷凍保護劑,，則可保護細胞免受溶質(zhì)損傷和冰晶損傷。因為冷凍保護劑容易同溶液中的水分子結合,，從而降低冰點,，減少冰晶的形成，并且通過其摩爾濃度降低未結冰溶液中電解質(zhì)的濃度,，使細胞免受溶質(zhì)損傷,，細胞得以在超低溫條件下保存。
在復蘇時,，一般以很快的速度升溫,，1-2分鐘內(nèi)即恢復到常溫，細胞內(nèi)外不會重新形成較大的冰晶,，也不會暴露在高濃度的電解質(zhì)溶液中過長的時間,，從而無冰晶損傷和溶質(zhì)損傷產(chǎn)生，凍存的細胞經(jīng)復蘇后仍保持其正常的結構和功能,。冷凍保護劑對細胞的冷凍保護效果還與冷凍速率,、冷凍溫度和復溫速率有關。而且不同的冷凍保護劑其冷凍保護效果也不一樣,。早期常用的冷凍保護劑為甘油,，現(xiàn)在用的比較多的是二甲亞砜(DMSO)。
冷凍速率：不同的冷凍速度既然能使細胞內(nèi)發(fā)生不同的生理變化,，也可以對細胞產(chǎn)生不同的損傷,。當冷凍速度過慢時，細胞脫水嚴重,，細胞體積嚴重收縮,，超過一定程度時即失去活性。同時冷凍速度過慢,，還會引起細胞外溶液部分結冰,，從而使細胞外未結冰的溶液中溶質(zhì)濃度增高，產(chǎn)生溶質(zhì)損傷,。當冷凍速度過快時,，細胞內(nèi)水分來不及外滲，會形成較多冰晶,，造成細胞膜及細胞器的破壞,，產(chǎn)生細胞內(nèi)冰晶損傷。
不同細胞的最適冷凍速率不同,。小鼠骨髓干細胞,、酵母、人紅細胞的最適冷凍速率分別為1.6°C/min,、7°C/min和200°C/min,。細胞與細胞之間的最適冷凍速率可在1.6°C～300°C/min，故對一種細胞進行冷凍保存之前,，首先需要測定其最適冷凍速率,，以保證獲得最高的冷凍存活率。
冷凍保存溫度：冷凍保存溫度是指能長期保存細胞的超低溫度,，在此溫度下,，細胞生化反應極其緩慢甚至停止，但經(jīng)過長期保存,，在復蘇后仍能保持正常的結構和功能,。
不同的細胞和生物體以及使用不同的冷凍保存方法要取得同樣的冷凍保存效果，冷凍保存溫度可以不同,。但從實際和效益的觀點出發(fā),，液氮溫度(-196°C)是目前最佳的冷凍保存溫度,。在-196°C時，細胞的生命活動幾乎*停止,，但復蘇后細胞的結構和功能完好,。如果冷凍過程得當，一般生物樣品在-196°C下均可保存十年以上,。應用-70°C～-80°C保存細胞,，短期內(nèi)對細胞的活性無明顯影響，但隨著凍存時間延長,，細胞存活率明顯降低,。在冰點到-40°C范圍內(nèi)保存細胞的效果不佳。
細胞凍存的步驟：
常用冷凍設備和材料：
常用的細胞冷凍貯存器為液氮貯存器,。
使用時要注意以下幾點：
(1)一般兩周需充液氮一次,，至少一個月充氮一次。液氮溫度達-196℃,，使用時注意勿讓液氮濺到皮膚上,，以免引起凍傷。
(2)液氮容器為雙層結構,，中間為真空層,，瓶口有雙層焊接處，應防止焊接部裂開,。
(3)在裝入液氮時,，要注意緩慢小心，并用厚紙卷筒或特制漏斗作引導,，使液氮直達瓶底,，如有專用液氮灌注裝置則更好。若為初次使用,，加液氮時更要緩慢,，以免溫度驟降而使容器損壞。
細胞凍存時常備的材料有：0.25%胰蛋白酶,，含10%～20%的血清培養(yǎng)液,，DMSO(分析純)或無色新鮮甘油(121°C蒸氣高壓消毒)，專用細胞凍存管,、吸管,、離心管、噴燈,、紗布袋(或凍存管架)等,。
細胞凍存操作步驟：
(1)選擇處于對數(shù)生長期的細胞，在凍存前一天最好換液。將多個培養(yǎng)瓶中的細胞培養(yǎng)液去掉,，用0.25%胰蛋白酶消化,。適時去掉胰蛋白酶，加入少量新培養(yǎng)液,。用吸管吸取培養(yǎng)液反復吹打瓶壁上的細胞,，使其成為均勻分散的細胞懸液。懸浮生產(chǎn)細胞則不要消化處理,。然后將細胞收集于離心管中離心(1000r/min，10分鐘),。
(2)去上清液,，加入含20%小牛血清的*培養(yǎng)基，于4℃預冷15分鐘后,，逐滴加入已無菌的DMSO或甘油,，用吸管輕輕吹打使細胞均勻。
(3)將上述細胞分裝于凍存管中,，封口處要*封閉,，圓滑無勾。冷凍管要將蓋子蓋緊,，并標記好細胞名稱和凍存日期,，同時作好登記(日期、細胞種類及代次,、凍存支數(shù)),。
(4)將裝好細胞的凍存管裝入凍存盒內(nèi)；置于液氮容器頸口處存放過夜,，次日轉入液氮中,。采用控制降溫速度的方法也可采用下列步驟：先將凍存管置入4℃冰箱中2～3小時，再移至冰箱冷凍室內(nèi)3～4小時,，再吊入液氮容器頸氣態(tài)部分存放2小時,，最后沉入液氮中。