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細(xì)胞凍存,我們應(yīng)該注意哪些事項,？
閱讀：3809 發(fā)布時間：2021-9-2
有人說，養(yǎng)細(xì)胞像養(yǎng)孩子,，要小心翼翼地伺候,。其實不然,，養(yǎng)細(xì)胞像養(yǎng)祖宗才對。孩子仍可罵可教育,，但如果你對細(xì)胞粗暴一點,，他會分分鐘不開心，讓你難堪,。這么嬌貴的祖宗,，我建議凍存一些，有以下幾個好處：
1,、留給師弟師妹們,，留個好名聲；
2,、避免“祖宗”掛了無儲備。
今天給大家分享一些凍存細(xì)胞的注意事項：
1,、凍存細(xì)胞的效果好壞要看細(xì)胞復(fù)蘇時的存活率,。細(xì)胞凍存時，細(xì)胞內(nèi)部會產(chǎn)生晶體,，水凝固形成的高濃度溶質(zhì)會對細(xì)胞產(chǎn)生損傷,，所以在凍存過程中要盡可能降低晶體的產(chǎn)生。為了提高復(fù)蘇存活率,，可通過以下方法完成：
a.降溫的速度不能太快,，讓細(xì)胞內(nèi)的水分緩慢離開細(xì)胞；
b.在低溫環(huán)境下凍存細(xì)胞可以降低高濃度鹽對細(xì)胞中蛋白質(zhì)的影響,；
c.凍存試劑要采用親水的低溫保護劑,；
d.復(fù)蘇時的速度要快，這樣可以減少細(xì)胞內(nèi)部冰晶溶解時產(chǎn)生的某些可溶性成分,。
2,、凍存細(xì)胞是為了留種，所以要選擇高濃度的細(xì)胞量進行凍存,。正常情況下,，當(dāng)細(xì)胞濃度達到1*105/ml時即可凍存，具體是多少量主要根據(jù)個人觀察,。
3,、二甲基亞砜（DMSO)因為穿透細(xì)胞的能力較強，因此作為常用的凍存劑,，也可以叫做細(xì)胞保護劑加入到細(xì)胞懸液中,。網(wǎng)上有些分享說道，如果選用DMSO,，整個細(xì)胞懸液的制作過程都要在4℃環(huán)境下進行,。本人采用過這種方法凍存過A549和某一原代細(xì)胞,，發(fā)現(xiàn)A549復(fù)蘇存活率和正常凍存的過程相比并沒有明顯區(qū)別，而原代細(xì)胞的接種率確實有所上升,，可能是因為是A549細(xì)胞比較皮實,，這種方法更適用于比較脆弱的細(xì)胞吧。
4,、凍存液比例一般是培養(yǎng)基：血清：DMSO=7:2:1或5:4:1,；動物種屬的原代細(xì)胞凍存液可采用的比例是培養(yǎng)基：血清：DMSO=0:9:1，即直接用血清重懸細(xì)胞再加入DMSO,，盡管如此,，原代細(xì)胞的復(fù)蘇成活率還是很低。
5,、有文獻表明,，細(xì)胞以l℃/min的速度冷凍存活率最髙，因為這一速度可以很好的控制細(xì)胞內(nèi)部晶體的產(chǎn)生,。我們實際操作不可能將速度控制的這么精確,，目前慣用的就是4℃30min、-20℃1h30min,、-80℃2h后轉(zhuǎn)入液氮中,。
6、正常情況下,，經(jīng)過-20℃1h30min這一步后,，凍存管內(nèi)的細(xì)胞已經(jīng)處于凝固狀態(tài)，如果此時凍存管內(nèi)還是液體,，很可能是DMSO或冰箱冷凍功能出現(xiàn)了問題,。如若遇到這種情況，不能因為時間到了,，就把把液體狀態(tài)的凍存管放置到液氮中,，可以適當(dāng)延長在-20℃環(huán)境下的冷凍時間30-60分鐘，直至凍存液凝固后再放到液氮中,。
7,、凍存記錄要表明細(xì)胞的種類、凍存之前的狀態(tài)和大致數(shù)量,、凍存時間和操作者,。
8、液氮內(nèi)的細(xì)胞凍存最長時間不要超過半年,，凍存在液氮中的細(xì)胞應(yīng)一段時間內(nèi)進行更替,。一個細(xì)胞系在培養(yǎng)一個月后，可復(fù)蘇一管新的細(xì)胞確保其質(zhì)量沒有發(fā)生太大變化，傳代幾次后,，再凍存留種,。
9、細(xì)胞復(fù)蘇時,，為保證獲得較高的存活率和接種率,，應(yīng)盡可能的快速完成復(fù)蘇，以避免在升溫過程中細(xì)胞內(nèi)部晶體的產(chǎn)生,。書面介紹的復(fù)蘇溫度是37℃-42℃,，但是本人在實際操作中發(fā)現(xiàn)40℃環(huán)境下復(fù)蘇。
10,、復(fù)蘇時的凍存管一定要密封好,，以免管內(nèi)外溫度和壓力不同導(dǎo)致凍存管炸裂。
11,、復(fù)蘇時使用的培養(yǎng)基和凍存時使用的培養(yǎng)基中的血清盡量保證同一批次,。
12、DMSO快速稀釋會對細(xì)胞造成滲透性損傷,，使存活率下降50%,。對于DMSO凍存的細(xì)胞，復(fù)蘇后應(yīng)緩慢稀釋成細(xì)胞懸液：
1.凍存液：培養(yǎng)基=1:1稀釋成細(xì)胞懸液后離心,，然后重懸至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，隔天換液,。
2.凍存液：培養(yǎng)基=1:10稀釋成細(xì)胞懸液,，不用離心，直接放置到培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)2-4小時后,，換液,。上述兩種方法都是比較常用的細(xì)胞復(fù)蘇方法，后者更適用于原代細(xì)胞或比較難養(yǎng)的細(xì)胞,。