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1,、提高實驗的效率
1)實驗前有計劃安排,、預(yù)備方案或者“車輪戰(zhàn)"(細胞實驗)
一般從基礎(chǔ)的培養(yǎng)細胞開始,,開始實驗時,,實驗方法一般來自于實驗室或者文獻中條件優(yōu)化以及自我推測及驗證,,因此做實驗之前預(yù)想實驗方案有助于我們不至于“手忙腳亂",。
以實驗前的細胞鋪板實驗為例:
表1 常用細胞培養(yǎng)體系:
細胞鋪板的孔數(shù)一般取決于我們后期實驗的目的,實驗前了解各類細胞的鋪板數(shù)量以及培養(yǎng)基添加量都十分重要,。以病毒或者細菌感染細胞模型來說,,我們需要一個比較準確數(shù)量級的細胞數(shù)目和病毒或菌液濃度得后期實驗的MOI值,細胞計數(shù)和病毒及菌液濃度測定也很關(guān)鍵,;
細胞鋪板:我們需要收集盡可能多的細胞,,原因是當我們剩余出來的細胞可用于細胞傳代繼續(xù)保留,可若是鋪板數(shù)量達不到(重新離心收集細胞浪費時間)可能會導(dǎo)致加藥濃度過大使得細胞大量死亡而影響后期實驗,,比如你要提取RNA或者蛋白,,細胞數(shù)目不足,后期的RNA濃度或者BCA測蛋白濃度的結(jié)果都不是非常理想繼而影響后面實驗的進展。
2)具體安排(Western blot實驗)
從試驗干擾開始(給藥處理),,根據(jù)實驗步驟來講,,完整的Western blot實驗預(yù)計2-3天。
(1)以給藥時間24h為例:24h后,,收集細胞提取蛋白,,貼壁細胞加IP裂解液或RIPA裂解液用細胞刮板移至1.5ml離心管;懸浮細胞收集細胞至離心管離心去除培養(yǎng)基,,用PBS清洗離心去除上清再加入裂解液,,預(yù)計提取蛋白以及BCA測蛋白濃度一上午的時間,估計上樣體積加入loading buffer煮蛋白置于-80℃保存,;下午跑蛋白電泳,,SDS-PAGE膠可于前一天晚上制好防止-4℃冰箱保存(用少量純水用封裝袋保存)或使用預(yù)制膠,大概1多小時蛋白maker跑到距離膠最下面1-2cm處停止電泳,;轉(zhuǎn)模,,根據(jù)目的蛋白的大小確定轉(zhuǎn)膜時間和毫安數(shù),結(jié)束后裁膜用5%脫脂奶粉封閉,,之后孵育一抗4℃過夜,,第二天洗膜孵育二抗并進行顯影,因此步驟時間熟練的話2天就可以完成一次WB實驗,。
(2)預(yù)備方案:實驗重復(fù)是不可避免的,,因此預(yù)備下一周期實驗方案(車輪戰(zhàn))有助于縮短時間提高效率,當然,,師兄師姐以及廣大學(xué)術(shù)里的經(jīng)驗小tips也有助于提高實驗效率,。例如,在WB配制SDS-PAGE膠的凝固時間通常會隨季節(jié)溫度的變化而改變,,夏季和冬季應(yīng)該時間就會產(chǎn)生差異(冬季凝固較慢),,再者,AP 和TEMED 作為促凝劑,,一般都是最后加入,,尤其是AP(過硫酸銨)。實驗之前我們可能都會設(shè)計一個預(yù)期結(jié)果,,我們可以在上一周期實驗的空余時間預(yù)備下一周所需要的實驗條件,,例如重新細胞鋪板給藥等待時間周期等等。
2,、提高實驗結(jié)果的質(zhì)量:減小系統(tǒng)誤差,,消除人為錯誤
以qPCR為例:該實驗檢測基因的mRNA表達水平,操作過程要求一定的準確性,,因為加樣體系較小,,各試劑的加樣量更要求精準,,下面是一些來自個人的小tips:
①減小系統(tǒng)誤差:一般設(shè)計3個重復(fù)孔,但是后期我統(tǒng)計數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn),,誤差bar仍可能較長,,這時我們可以設(shè)計4個復(fù)孔,去除一個誤差最大的值也有助于結(jié)果的準確性,。這時就要求我們會更加精準的使用移液槍,。另外,重復(fù)實驗也有助于提高我們加樣的準確性,。
②制備預(yù)混液:例如我要做30(2×5×3)孔兩個基因(包含內(nèi)參),,5個處理,3個復(fù)孔,,那么我的熒光染料一個孔需要5ul,正反引物2ul,,那么我們可以再不浪費試劑的情況下,,計算量可為:15.5×5+15.5×2或者(15×5+15×2)×1.1,這一定程度上都是為了消除我們?nèi)藶榧訕诱`差,。
③另外我們盡量增大加樣體積減少誤差:針對于10ul體系,,提前將正反引物混合,配制SYBY+正反引物和cDNA+ddH2O,,這時的體積為6+4或者7+3可減少加樣體積小帶來的加樣誤差,。
④相關(guān)試劑使用前需離心使用:另外,在八聯(lián)管上機前需要用干凈的手套蓋上透明蓋子,,適當離心將反應(yīng)體系離心至管底,。
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