細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染是一種常用的基因傳遞技術(shù),，其中慢病毒轉(zhuǎn)染作為一種有效的手段被廣泛采用,。通過慢病毒載體，可將目的基因序列穩(wěn)定地整合到宿主細(xì)胞基因中,，實(shí)現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達(dá),。這種轉(zhuǎn)染方法不僅能夠在多種細(xì)胞系中高效地實(shí)現(xiàn)基因傳遞，還能夠?qū)崿F(xiàn)對特定基因的穩(wěn)定表達(dá),，為基因功能研究和細(xì)胞工程提供了重要工具,。

早在1981年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)并研究了人類免疫缺陷病毒I型（HIV-1），從而掀開了慢病毒作為載體的研究序幕。慢病毒（Lentivirus）載體是通過HIV-1進(jìn)行改造而得到的,，其具備感染細(xì)胞的能力,，包括分裂期和非分裂期細(xì)胞，同時(shí)在宿主體內(nèi)能夠?qū)崿F(xiàn)長期表達(dá)且具備較高的安全性,。這種載體能夠穩(wěn)定表達(dá)外源基因，具有廣泛的感染范圍等優(yōu)勢，因此在基因過表達(dá),、RNA干擾、miRNA研究等實(shí)驗(yàn)中得到廣泛應(yīng)用,。

一,、實(shí)驗(yàn)步驟

1、提前一天準(zhǔn)備細(xì)胞

在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前一天,，首先對293T細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化處理,，并將其培養(yǎng)于10厘米培養(yǎng)皿中，以確保細(xì)胞能夠充分貼壁且密度達(dá)70%-80%,。隨后,，將細(xì)胞置于37攝氏度、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育8至24小時(shí),，待細(xì)胞全部貼壁后即可開始進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作,。

2、轉(zhuǎn)染

1）轉(zhuǎn)染前,，需換液,，使用10毫升血清培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基。

2）制備混合物包括包裝質(zhì)粒和目的質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑,；

a. 將8µg 目的質(zhì)粒和16µg 病毒包裝質(zhì)粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)加入到1ml 無血清Opti-DMEM,，充分混合；

b. 將50µl轉(zhuǎn)染試劑溶于1ml Opti-DMEM中,，充分混合,，靜置5分鐘；

c. 將轉(zhuǎn)染試劑稀釋液滴加入質(zhì)粒稀釋液中，邊滴加邊輕輕混合,，然后在室溫下靜置20分鐘,，使DNA和轉(zhuǎn)染試劑充分結(jié)合形成穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染復(fù)合物。取出培養(yǎng)皿,，將配制好的DNA-轉(zhuǎn)染試劑混合物加入培養(yǎng)皿中,，輕輕混合，標(biāo)記后放回培養(yǎng)箱中,；

3）經(jīng)過6~8小時(shí)后,，吸除培養(yǎng)基，用4ml PBS清洗一次,，然后加入8ml 新鮮血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng),。

3、收病毒

進(jìn)行轉(zhuǎn)染后,，每隔24小時(shí)將培養(yǎng)上清收集至50毫升離心管中,，進(jìn)行適當(dāng)標(biāo)記，并為細(xì)胞更換新鮮的血清培養(yǎng)基,。在最后一次收集病毒液后,，應(yīng)將接觸過病毒的槍頭、離心管,、培養(yǎng)皿等物品浸泡于84消毒液中進(jìn)行消毒處理,，然后安全丟棄。

4,、包裝病毒

貼壁細(xì)胞：

1）慢病毒轉(zhuǎn)染前一天,，將貼壁細(xì)胞鋪到24孔板中，確保每孔約有2×10^5個(gè)細(xì)胞,。第二天,，在37攝氏度下使用含有6 μg/ml polybrene的2毫升新鮮培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基，并加入適量病毒懸液孵育,。

2）對于polybrene毒性敏感的細(xì)胞,，在轉(zhuǎn)染后4小時(shí)內(nèi)加入2毫升新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3）繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),，然后用新鮮培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)基,。

4）繼續(xù)傳代培養(yǎng)，如果慢病毒含有熒光蛋白,，在轉(zhuǎn)染后48小時(shí)通?？捎^察到明顯的熒光表達(dá)，72小時(shí)后表達(dá)更為明顯,，如果慢病毒含有抗性基因并需要進(jìn)行藥物篩選,，則可在轉(zhuǎn)染3-4天后開始添加藥物,。

懸浮細(xì)胞：

1）將濃度為6 μg/ml 的polybrene加入2×10^5/ml懸浮細(xì)胞中,，并加入適量病毒,，充分混勻后在37攝氏度下孵育?；蛘哌M(jìn)行室溫離心,，離心速度為150g，持續(xù)4小時(shí)（對于難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系,，可選擇此步驟以提高轉(zhuǎn)染效率）,。

2）對于對polybrene毒性敏感的細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后4小時(shí),，加入相同體積的新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene。

3）繼續(xù)培養(yǎng)3-4天,。根據(jù)細(xì)胞生長情況,，可以進(jìn)行細(xì)胞傳代或者更換培養(yǎng)基

二、注意事項(xiàng)

1）進(jìn)行慢病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)時(shí)要注意安全,，穿實(shí)驗(yàn)服,，戴口罩和手套。

2）在操作病毒時(shí)務(wù)必小心,，避免產(chǎn)生氣霧或飛濺,，所有接觸過病毒的工具，如槍頭,、離心管,、培養(yǎng)皿以及培養(yǎng)液，請浸泡在84消毒液中過夜后,，確保全部消毒后再進(jìn)行處理,。

3）病毒操作時(shí)要使用生物安全柜，如果使用普通超凈工作臺,，不能打開風(fēng)機(jī),。

4）如果加入Puromycin后觀察到細(xì)胞死亡較多，務(wù)必及時(shí)更換培養(yǎng)基,，以防止死細(xì)胞釋放的有害物質(zhì)影響到具有抗性的細(xì)胞的生長,。

5）需注意病毒液的儲存方式：若在短時(shí)間內(nèi)（3天內(nèi)）需要使用，可將病毒液存放于4攝氏度的冰箱中,。然而,，若無法在短期內(nèi)全部使用，建議將慢病毒液分裝后置于-80攝氏度的冰箱中保存,。在分裝時(shí)應(yīng)根據(jù)每次使用的量進(jìn)行,，將準(zhǔn)確的病毒液分裝至凍存管中，并做好日期和儲存量的標(biāo)記，封口膜密封以確保密封性,。病毒液在-80攝氏度的冰箱中可保存約6個(gè)月,。

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