細胞穩(wěn)定轉染是一種常用的基因傳遞技術，其中慢病毒轉染作為一種有效的手段被廣泛采用,。通過慢病毒載體,，可將目的基因序列穩(wěn)定地整合到宿主細胞基因中，實現(xiàn)長期穩(wěn)定的表達,。這種轉染方法不僅能夠在多種細胞系中高效地實現(xiàn)基因傳遞,，還能夠實現(xiàn)對特定基因的穩(wěn)定表達，為基因功能研究和細胞工程提供了重要工具,。

早在1981年,，科學家們發(fā)現(xiàn)并研究了人類免疫缺陷病毒I型（HIV-1），從而掀開了慢病毒作為載體的研究序幕,。慢病毒（Lentivirus）載體是通過HIV-1進行改造而得到的,，其具備感染細胞的能力，包括分裂期和非分裂期細胞,，同時在宿主體內能夠實現(xiàn)長期表達且具備較高的安全性,。這種載體能夠穩(wěn)定表達外源基因，具有廣泛的感染范圍等優(yōu)勢,，因此在基因過表達,、RNA干擾、miRNA研究等實驗中得到廣泛應用,。

一,、實驗步驟

1,、提前一天準備細胞

在進行轉染前一天,，首先對293T細胞進行胰酶消化處理，并將其培養(yǎng)于10厘米培養(yǎng)皿中,，以確保細胞能夠充分貼壁且密度達70%-80%,。隨后，將細胞置于37攝氏度,、含有5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育8至24小時,，待細胞全部貼壁后即可開始進行轉染操作。

2,、轉染

1）轉染前,，需換液，使用10毫升血清培養(yǎng)基替換舊的培養(yǎng)基,。

2）制備混合物包括包裝質粒和目的質粒與轉染試劑,；

a. 將8µg 目的質粒和16µg 病毒包裝質粒(psPAX2：pMD2.G=1:1)加入到1ml 無血清Opti-DMEM，充分混合,；

b. 將50µl轉染試劑溶于1ml Opti-DMEM中,，充分混合，靜置5分鐘；

c. 將轉染試劑稀釋液滴加入質粒稀釋液中,，邊滴加邊輕輕混合,，然后在室溫下靜置20分鐘，使DNA和轉染試劑充分結合形成穩(wěn)定的轉染復合物,。取出培養(yǎng)皿,，將配制好的DNA-轉染試劑混合物加入培養(yǎng)皿中，輕輕混合,，標記后放回培養(yǎng)箱中,；

3）經(jīng)過6~8小時后，吸除培養(yǎng)基,，用4ml PBS清洗一次,，然后加入8ml 新鮮血清培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。

3,、收病毒

進行轉染后,，每隔24小時將培養(yǎng)上清收集至50毫升離心管中，進行適當標記,，并為細胞更換新鮮的血清培養(yǎng)基,。在最后一次收集病毒液后，應將接觸過病毒的槍頭,、離心管,、培養(yǎng)皿等物品浸泡于84消毒液中進行消毒處理，然后安全丟棄,。

4,、包裝病毒

貼壁細胞：

1）慢病毒轉染前一天，將貼壁細胞鋪到24孔板中,，確保每孔約有2×10^5個細胞,。第二天，在37攝氏度下使用含有6 μg/ml polybrene的2毫升新鮮培養(yǎng)基替換原有培養(yǎng)基,，并加入適量病毒懸液孵育,。

2）對于polybrene毒性敏感的細胞，在轉染后4小時內加入2毫升新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene,。

3）繼續(xù)培養(yǎng)24小時,，然后用新鮮培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)基。

4）繼續(xù)傳代培養(yǎng),，如果慢病毒含有熒光蛋白,，在轉染后48小時通常可觀察到明顯的熒光表達,，72小時后表達更為明顯,，如果慢病毒含有抗性基因并需要進行藥物篩選,，則可在轉染3-4天后開始添加藥物。

懸浮細胞：

1）將濃度為6 μg/ml 的polybrene加入2×10^5/ml懸浮細胞中,，并加入適量病毒,，充分混勻后在37攝氏度下孵育?；蛘哌M行室溫離心,，離心速度為150g，持續(xù)4小時（對于難以轉染的細胞系,，可選擇此步驟以提高轉染效率）,。

2）對于對polybrene毒性敏感的細胞，轉染后4小時,，加入相同體積的新鮮培養(yǎng)基以稀釋polybrene,。

3）繼續(xù)培養(yǎng)3-4天。根據(jù)細胞生長情況,，可以進行細胞傳代或者更換培養(yǎng)基

二,、注意事項

1）進行慢病毒相關實驗時要注意安全，穿實驗服,，戴口罩和手套,。

2）在操作病毒時務必小心，避免產(chǎn)生氣霧或飛濺,，所有接觸過病毒的工具,，如槍頭、離心管,、培養(yǎng)皿以及培養(yǎng)液,，請浸泡在84消毒液中過夜后，確保全部消毒后再進行處理,。

3）病毒操作時要使用生物安全柜,，如果使用普通超凈工作臺，不能打開風機,。

4）如果加入Puromycin后觀察到細胞死亡較多，務必及時更換培養(yǎng)基,，以防止死細胞釋放的有害物質影響到具有抗性的細胞的生長,。

5）需注意病毒液的儲存方式：若在短時間內（3天內）需要使用，可將病毒液存放于4攝氏度的冰箱中,。然而,，若無法在短期內全部使用，建議將慢病毒液分裝后置于-80攝氏度的冰箱中保存,。在分裝時應根據(jù)每次使用的量進行,，將準確的病毒液分裝至凍存管中,，并做好日期和儲存量的標記，封口膜密封以確保密封性,。病毒液在-80攝氏度的冰箱中可保存約6個月,。

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