一,、前言

每一個(gè)生命個(gè)體都是由無數(shù)精妙的生物分子共同組成的。而其中的DNA就像是生命的藍(lán)圖,，DNA中的每一段特定序列,，即我們所稱的基因，各自承擔(dān)著特定的生物學(xué)功能,。它們共同調(diào)控著生物體的生長,、發(fā)育、繁殖等一系列復(fù)雜的生命過程,。然而,，并非所有基因都是十全十美的，有時(shí)候,，基因中的一點(diǎn)小小改變,，就可能導(dǎo)致疾病的產(chǎn)生。但如果我們能夠像編輯文字一樣編輯這些基因,，那我們就有可能修復(fù)這些錯(cuò)誤,，治療疾病，甚至創(chuàng)造出新的生命形式,。這個(gè)想法并非遙不可及,。在21世紀(jì)的今天，一種名為"基因編輯"的技術(shù)正在逐漸實(shí)現(xiàn)這個(gè)夢想,，它正在深刻地改變我們對生命的理解和認(rèn)知,。

自1970年以來，基因工程已經(jīng)成為一種在生物體中引入新遺傳成分的主要手段,。但這項(xiàng)技術(shù)有一個(gè)顯著的缺點(diǎn)：DNA的插入是隨機(jī)的,，不能精確地將基因定位到生物基因組內(nèi)的特定位點(diǎn)。這種隨機(jī)性可能會損害或改變宿主基因組中的其他基因,。

為了解決這個(gè)問題,，科學(xué)家們開始研發(fā)一系列的基因編輯技術(shù)。這些技術(shù)不僅能在基因組中插入新的基因,，還能精確地將這些基因定位到特定的位置,，避免對其他基因的無意干擾?；蚓庉嫾夹g(shù)的出現(xiàn),，使得我們能夠從“粗糙"的基因操作,，轉(zhuǎn)變?yōu)椤熬?xì)"的基因操作。這一系列突破性的研究不僅提高了基因操作的準(zhǔn)確性,，也為我們解決遺傳疾病和開發(fā)新的生物技術(shù)提供了更多可能性,。

二、基因編輯的原理

基因編輯的原理通常涉及到一種被稱為"分子剪刀"（如CRISPR-Cas9,，ZFNs或TALENs等）的工具,，它可以在DNA鏈的特定位置將其切斷。這個(gè)位置是由一段引導(dǎo)RNA（gRNA）確定的,，它能夠與目標(biāo)DNA序列精確配對,。一旦DNA被切斷，細(xì)胞的自我修復(fù)機(jī)制就會啟動,，試圖修復(fù)這個(gè)斷裂,。

當(dāng)DNA雙鏈斷裂（DSBs）發(fā)生時(shí)，細(xì)胞會啟動一系列復(fù)雜的自我修復(fù)機(jī)制,，試圖修復(fù)這個(gè)斷裂,。這些機(jī)制包括同源重組修復(fù)（HR）、非同源末端連接（NHEJ）,、選擇性末端連接（a-EJ）和單鏈退火修復(fù)（SSA）,。

同源重組修復(fù)（HR）：同源重組修復(fù)（HR）是一種精確的DNA修復(fù)機(jī)制，但它需要一個(gè)同源的DNA模板來指導(dǎo)修復(fù)過程,。同源模板通常來自于同源染色體或者姐妹染色單體,。在基因編輯中，我們可以為人提供一個(gè)包含我們希望插入或替換的DNA序列的同源模板,。通過精確控制模板的序列,，我們就可以實(shí)現(xiàn)精確的基因編輯,。但需要注意的是,，HR機(jī)制主要發(fā)生在細(xì)胞的S期和G2期，因?yàn)檫@兩個(gè)階段細(xì)胞具有可供參考的姐妹染色單體,。因此,，在使用HR機(jī)制進(jìn)行基因編輯時(shí)，我們通常需要考慮到細(xì)胞周期的影響,。

非同源末端連接（NHEJ）：非同源末端連接（NHEJ）可以將斷裂的兩個(gè)DNA末端直接連接起來，而不需要同源性模板,。這種機(jī)制的優(yōu)點(diǎn)是可以在任何階段的細(xì)胞周期中進(jìn)行，而不受細(xì)胞分裂階段的限制,。NHEJ的缺點(diǎn)是它不是一個(gè)精確的修復(fù)機(jī)制,。在末端連接的過程中,，可能會丟失或插入一些核苷酸，導(dǎo)致基因序列的改變,。這種改變可能會導(dǎo)致基因的功能喪失或改變,，所以NHEJ常常在無法提供同源模板的情況下被用于實(shí)現(xiàn)基因的突變和敲除。

選擇性末端連接（a-EJ）和單鏈退火修復(fù)（SSA）：這是兩種輔助性的DNA修復(fù)機(jī)制,，它們在特定的條件下被激活。a-EJ是一種不依賴于DNA-PKcs的末端連接機(jī)制,，通常在非同源末端連接（NHEJ）不能正常工作時(shí)被激活,。單鏈退火修復(fù)（SSA）則是一種依賴于大量的末端單鏈切除的修復(fù)機(jī)制。在SSA過程中,，兩個(gè)斷裂的DNA末端會被切除成單鏈,，然后這兩個(gè)單鏈會尋找并退火到相同的序列，最后通過切除和連接的方式修復(fù)斷裂,。這兩種修復(fù)機(jī)制都需要對斷裂的DNA末端進(jìn)行大量的切除,，以形成單鏈DNA，這可能會導(dǎo)致一些遺傳信息的丟失,。因此,，它們都不是精確的修復(fù)機(jī)制。但在基因編輯中,，我們可以巧妙地利用這些機(jī)制來實(shí)現(xiàn)特定基因的突變和敲除,。

而在DNA的自我修復(fù)過程中，科學(xué)家可以利用一種被稱為"修復(fù)模板"的DNA片段來引導(dǎo)修復(fù)過程,。這個(gè)修復(fù)模板包含了科學(xué)家想要插入,、刪除或更改的DNA序列。當(dāng)細(xì)胞的修復(fù)機(jī)制被激活時(shí),，它就會使用這個(gè)修復(fù)模板來修復(fù)DNA斷裂,。

三、鋅指核酸酶技術(shù)（ZFN）

鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)的發(fā)展始于20世紀(jì)80年代,。當(dāng)時(shí)的科學(xué)家在非洲爪蟾的調(diào)節(jié)因子中發(fā)現(xiàn)了鋅指蛋白（zinc finger protein,，ZFP）。這種蛋白能夠識別并結(jié)合到特定的DNA序列,。后來,，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)通過改造這些蛋白可以將其與FokI酶結(jié)合，產(chǎn)生成為一個(gè)能夠在特定DNA序列處切割DNA的工具,，前者負(fù)責(zé)識別,，后者負(fù)責(zé)切割DNA。這就是鋅指核酸酶,。

1,、ZFN技術(shù)的原理

ZFN由兩部分組成：鋅指蛋白（ZFP）和FokI內(nèi)切酶。ZFP是一種DNA結(jié)合蛋白,，它可以識別并結(jié)合到特定的DNA序列。FokI內(nèi)切酶是一種核酸酶,，它可以切割DNA。這兩部分結(jié)合在一起,，形成了一種可以在特定位置切割DNA的工具。

FokI內(nèi)切酶：FokI內(nèi)切酶是ZFN的切割部分,。它是一種核酸酶,，可以在DNA雙鏈上產(chǎn)生切口。然而,，F(xiàn)okI內(nèi)切酶只有在形成二聚體的情況下才能工作,。這也就意味著需要兩個(gè)ZFN分子在相鄰的DNA序列上結(jié)合，才能形成一個(gè)有效的FokI內(nèi)切酶二聚體,，從而切割DNA。

DNA切割和修復(fù)：當(dāng)ZFN在特定的DNA序列上產(chǎn)生切口后,，細(xì)胞的DNA修復(fù)機(jī)制就會啟動,。這通常會通過兩種途徑進(jìn)行：非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）。NHEJ是一種錯(cuò)誤修復(fù)機(jī)制,，它會在DNA切口處隨機(jī)添加或刪除堿基，從而導(dǎo)致基因突變,。HR則是一種精確的修復(fù)機(jī)制,，它需要一個(gè)與切口處的DNA序列相匹配的模板,，接著按照這個(gè)模板精確地修復(fù)切口。通過提供一個(gè)含有所需變更的DNA模板,，科學(xué)家們就可以利用HR機(jī)制來進(jìn)行精確的基因編輯。