一,、介紹

小鼠精原細胞（GC-1 spg）為貼壁細胞，細胞形態(tài)呈上皮細胞樣,。

二,、主要耗材、儀器及試劑

15ml離心管,、50ml離心管,、凍存管、巴氏滴管,、培養(yǎng)瓶,、封口膜、CO2培養(yǎng)箱,、離心機,、顯微鏡、生物安全柜,、DMEM,、胎牛血清（FBS）、PBS緩沖液,、青-鏈霉素（雙抗）,、胰蛋白酶、二甲基亞砜（DMSO）等等,。

三,、培養(yǎng)流程

1. 細胞復蘇

1)擦拭生物安全柜臺面，準備好所需耗材,，紫外30min,，打開37℃恒溫水浴箱預熱所用試劑；

2)按照DMEM＋10% FBS＋1% P/S的比例配制血清培養(yǎng)基,，吹打混勻后按10倍細胞的體積分裝至15ml離心管中,；

3)從液氮中取出GC-1 spg細胞,，在水浴箱中快速晃動使其融化；

4)將細胞懸液轉移至提前分裝有血清培養(yǎng)基的離心管中,，吹打混勻,；

5)1200rpm，離心3min,；

6)棄去廢液,，向離心管中重新加入新的培養(yǎng)基，重懸GC-1 spg細胞沉淀,，并轉移至培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),。

2. 細胞傳代

1)細胞密度超過80%即可進行傳代，拿出細胞,，棄去舊培養(yǎng)液,；

2)用PBS沖洗細胞2-3次（動作要輕柔，清洗時可搖晃培養(yǎng)瓶以保證清洗效果）,；

3)棄去廢液,，向培養(yǎng)瓶中加入事先預熱好的胰蛋白酶（用量要足以覆蓋細胞層），輕輕晃動培養(yǎng)瓶以利于消化,；

4)1min左右后在顯微鏡下觀察細胞,，當90%細胞被消化下來時，向培養(yǎng)瓶中加入2-3ml的血清培養(yǎng)基,，終止消化,；

5)收集細胞懸液至15ml離心管中，1200rpm,，離心3min,；

6)等待離心過程中，可提前在新的培養(yǎng)瓶中加好完培（如T25培養(yǎng)瓶可先加4ml完培）,；

7)棄去廢液，用2ml的完培重懸細胞后分裝至新的培養(yǎng)瓶中,；

8)蓋上培養(yǎng)瓶蓋子,，以劃“十字"的方式晃動培養(yǎng)瓶，以使細胞分布均勻,，置于37℃,，5%-10%CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。

3. 細胞凍存

1)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶,，棄去舊的培養(yǎng)液,，用PBS清洗2-3次；

2)加入預熱的胰蛋白酶消化細胞,，鏡下觀察消化后加入2-3ml完培終止消化,；

3)收集細胞懸液至15ml離心管中,，1200rpm，離心3min,；

4)等待離心過程中,，按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的比例配制凍存液；

5)離心結束后,，棄去上清,，向離心管中加入凍存液，重懸細胞,，分裝至凍存管中,；

6)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍"），置于-80℃冰箱中,，第二天即可拿出細胞置于液氮罐中保存,。

四、注意事項

1．培養(yǎng)細胞所用的培養(yǎng)基及血清等試劑最好沿用之前的,，切忌頻繁更換,；

2．棄去舊的培養(yǎng)液時最好不要直接倒掉，以免瓶口有殘留造成污染,；

3．用胰酶消化細胞時,，可輕輕晃動培養(yǎng)瓶，并在顯微鏡下觀察,，細胞間隙變大,，輕晃培養(yǎng)瓶細胞可自然流下時即可終止消化，切忌劇烈拍打培養(yǎng)瓶,；

4．對于難消化的細胞可以分兩次進行消化,，以防胰酶消化時間過長對細胞造成損傷；

5．一定要分清細胞培養(yǎng)瓶的正反面,。

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