一,、介紹

小鼠精原細(xì)胞（GC-1 spg）為貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈上皮細(xì)胞樣,。

二,、主要耗材、儀器及試劑

15ml離心管,、50ml離心管,、凍存管、巴氏滴管,、培養(yǎng)瓶,、封口膜、CO2培養(yǎng)箱,、離心機(jī),、顯微鏡,、生物安全柜、DMEM,、胎牛血清（FBS）,、PBS緩沖液、青-鏈霉素（雙抗）,、胰蛋白酶,、二甲基亞砜（DMSO）等等。

三,、培養(yǎng)流程

1. 細(xì)胞復(fù)蘇

1)擦拭生物安全柜臺面,，準(zhǔn)備好所需耗材，紫外30min,，打開37℃恒溫水浴箱預(yù)熱所用試劑,；

2)按照DMEM＋10% FBS＋1% P/S的比例配制血清培養(yǎng)基，吹打混勻后按10倍細(xì)胞的體積分裝至15ml離心管中,；

3)從液氮中取出GC-1 spg細(xì)胞,，在水浴箱中快速晃動使其融化；

4)將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至提前分裝有血清培養(yǎng)基的離心管中,，吹打混勻,；

5)1200rpm，離心3min,；

6)棄去廢液,，向離心管中重新加入新的培養(yǎng)基，重懸GC-1 spg細(xì)胞沉淀,，并轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng),。

2. 細(xì)胞傳代

1)細(xì)胞密度超過80%即可進(jìn)行傳代，拿出細(xì)胞,，棄去舊培養(yǎng)液,；

2)用PBS沖洗細(xì)胞2-3次（動作要輕柔，清洗時可搖晃培養(yǎng)瓶以保證清洗效果）,；

3)棄去廢液,，向培養(yǎng)瓶中加入事先預(yù)熱好的胰蛋白酶（用量要足以覆蓋細(xì)胞層），輕輕晃動培養(yǎng)瓶以利于消化,；

4)1min左右后在顯微鏡下觀察細(xì)胞,，當(dāng)90%細(xì)胞被消化下來時，向培養(yǎng)瓶中加入2-3ml的血清培養(yǎng)基,，終止消化,；

5)收集細(xì)胞懸液至15ml離心管中，1200rpm,，離心3min,；

6)等待離心過程中,，可提前在新的培養(yǎng)瓶中加好完培（如T25培養(yǎng)瓶可先加4ml完培）；

7)棄去廢液,，用2ml的完培重懸細(xì)胞后分裝至新的培養(yǎng)瓶中,；

8)蓋上培養(yǎng)瓶蓋子，以劃“十字"的方式晃動培養(yǎng)瓶,，以使細(xì)胞分布均勻,，置于37℃，5%-10%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),。

3. 細(xì)胞凍存

1)從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶,，棄去舊的培養(yǎng)液，用PBS清洗2-3次,；

2)加入預(yù)熱的胰蛋白酶消化細(xì)胞,，鏡下觀察消化后加入2-3ml完培終止消化；

3)收集細(xì)胞懸液至15ml離心管中,，1200rpm,，離心3min；

4)等待離心過程中,，按照55% DMEM+40%FBS+5%DMSO的比例配制凍存液,；

5)離心結(jié)束后，棄去上清,，向離心管中加入凍存液,，重懸細(xì)胞，分裝至凍存管中,；

6)將凍存管放入程序降溫盒中（“慢凍"）,，置于-80℃冰箱中,，第二天即可拿出細(xì)胞置于液氮罐中保存,。

四,、注意事項

1．培養(yǎng)細(xì)胞所用的培養(yǎng)基及血清等試劑最好沿用之前的,，切忌頻繁更換,；

2．棄去舊的培養(yǎng)液時最好不要直接倒掉,，以免瓶口有殘留造成污染,；

3．用胰酶消化細(xì)胞時,，可輕輕晃動培養(yǎng)瓶,，并在顯微鏡下觀察，細(xì)胞間隙變大,，輕晃培養(yǎng)瓶細(xì)胞可自然流下時即可終止消化,，切忌劇烈拍打培養(yǎng)瓶；

4．對于難消化的細(xì)胞可以分兩次進(jìn)行消化,，以防胰酶消化時間過長對細(xì)胞造成損傷,；

5．一定要分清細(xì)胞培養(yǎng)瓶的正反面,。

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