（一）同樣大小的DNA一起跑電泳，怎么條帶不一樣大,？

DNA條帶不一樣大,，本質(zhì)上是DNA在凝膠中的遷移率不一樣，有的跑得快,，有的慢,，通常情況同樣大小的DNA，遷移率是一樣的,，條帶位置也會一樣,。

但遷移率也受很多因素影響，例如DNA的構(gòu)象,。例如環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA,，和同等大小的線性DNA（例如單位點酶切后的質(zhì)粒），前者的遷移率要高,，表現(xiàn)出來就是看上去超螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子量好像小一點,。

（二）為什么有時候加大電泳的電壓，DNA會跑得快,，但有時效果卻不明顯,？

在較低電壓時，提高電壓,，DNA的遷移率也會提高,；但如果DNA分子量太大時，增加電壓后對DNA遷移率的提高其實不成比例,，說白一點,，就是有效果，但不明顯,。

例如,，當(dāng)DNA分子量大于2Kb后，施加在電泳槽兩端的電壓不應(yīng)該高于5V/cm,，如果電泳槽長40cm,，那么電壓不應(yīng)該高于200V。

（三）瓊脂糖質(zhì)量對電泳效果有多大影響,？

有時候,，換了一個批次的瓊脂糖，或者更換了新的供應(yīng)商的瓊脂糖后,，同樣的樣品進(jìn)行電泳,，效果也會有差異。

最常見的一個原因在于,，瓊脂糖本身的質(zhì)量也是影響電泳結(jié)果的一個因素,。

瓊脂糖由大量的多糖組成，這些多糖會與硫酸鹽吸附,，成為一種叫硫酸化多糖的東西,。在電泳時，它會產(chǎn)生正電荷,，并向陰極移動,，也就是和DNA移動的方向相反。

最終,，DNA移動的阻力就增加了,。這種現(xiàn)象叫做瓊脂糖的電內(nèi)滲（EEO）。因此,，采購低水平電內(nèi)滲的瓊脂糖能有效提高分離效果,。

（四）電泳緩沖液對電泳效果有多大影響,？

電泳時，電泳緩沖液是一種經(jīng)常需要更換的試劑,。

最佳的狀態(tài),，應(yīng)該是，使用同一批次的電泳緩沖液母液進(jìn)行1X電泳緩沖液的配置和對應(yīng)檔次電泳的凝膠配置,。因為只有這樣操作,，才能保證整個離子緩沖環(huán)境是一致的。

有時我們會為了圖方便,，長期使用一個批次的1X電泳緩沖液進(jìn)行實驗,，甚至到了母液都用完了，還在用之前那個批次的緩沖液進(jìn)行實驗,。這樣就會影響實驗效果了,。

另外，常見的電泳緩沖液的使用錯誤,，還包括,，直接倒入自來水替代電泳緩沖液，或者直接使用10X或50X的母液當(dāng)緩沖液進(jìn)行電泳,?！?/span>

前者因為緩沖體系內(nèi)缺乏足夠的離子，造成電導(dǎo)率很低,，DNA遷移速度很慢,，甚至是靜止了；而后者則因為電導(dǎo)率太高,，造成整個緩沖液產(chǎn)熱太厲害,，甚至連凝膠都融化了。

（五）低熔點瓊脂糖和普通瓊脂糖有什么區(qū)別,？有什么用途,？

制作瓊脂糖的原料通常是兩種海藻：Gelidium和Gracilaria。普通的瓊脂糖通?？梢苑蛛x1～25Kb范圍的DNA片段,，熔化溫度一般在85～90攝氏度，凝固溫度一般在40～42攝氏度,。

對普通瓊脂糖進(jìn)行固化劑1號修飾后,，可以降低瓊脂糖的熔化溫度。有的熔化溫度甚至低至40～45攝氏度,！

這么低的熔化溫度有什么意義和應(yīng)用呢,？答案是低熔點瓊脂糖主要應(yīng)用于DNA的快速回收，想象一下，在比較低的溫度時,，例如50～60攝氏度,，低熔點的凝膠已經(jīng)熔化了，但這個溫度下DNA還是很穩(wěn)定,，不會解鏈的,。

因此，只需要進(jìn)行簡單的處理和升溫就能實現(xiàn)DNA的回收,，而且這種回收得到的DNA還能直接進(jìn)行一些下游實驗，例如細(xì)菌轉(zhuǎn)化,。

（六）電泳緩沖液就是TAE buffer嘛,？還有其他嘛？有什么區(qū)別,？

其實,，瓊脂糖電泳緩沖液有幾種，分別是TAE,、TBE和TPE,，不過常用的一般是TAE。下面就來看看這三種緩沖液有什么區(qū)別,。

相同點：大家都是為電泳提供一個離子緩沖環(huán)境,。

不同點：組份不同，對應(yīng)的緩沖能力不同,，應(yīng)用場景也略有不同,。我們具體來看看。

TAE：Tris-乙酸鹽+EDTA緩沖液組成,；緩沖能力最弱,，如果長時間的電泳，則不適合,。其中一個標(biāo)志是長時間電泳后,，凝膠的陽極一側(cè)會發(fā)生酸化，凝膠中的溴酚藍(lán)會從藍(lán)色變?yōu)辄S色,。因此,，TAE需要定期更換，才能保證電泳效果,。

TBE: Tris-硼酸鹽+EDTA緩沖液組成,；TPE：Tris-磷酸鹽+EDTA緩沖液組成；緩沖能力比TAE要高,，DNA在后兩種緩沖液中的遷移速度較慢,，適用于分離低分子量DNA的電泳實驗。

（七）上樣緩沖液是什么？有什么用,？

在正式電泳開始之前,，常使用上樣緩沖液(loading buffer)來與樣品DNA混合，這種緩沖液在電泳時有什么用呢,？

Loading buffer在瓊脂糖凝膠電泳中的作用主要有三個：

01 它可以增加樣品的密度,，確保DNA樣品可以均勻沉入上樣孔內(nèi)；

02 Loading buffer含有顏色指示劑,，除了幫助上樣時觀察樣品是否準(zhǔn)確加入孔內(nèi)

03 這種顏色指示劑主要由溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán)FF組成,，它們兩者在電泳中會按照固定的遷移速度移動，所以,，我們還可以在電泳時通過Loading buffer幫助我們觀察條帶的遷移進(jìn)度

（八）電泳條帶看起來像個微笑的表情是什么原因,？

最常見的原因是因為上樣量太大了，常見的凝膠孔位的寬度是5mm,，如果往里面加載的樣品超過0.5ug的話,，就表明過量了。

最后,，電泳時就會出現(xiàn)條帶兩側(cè)卷起彎曲（像微笑表情）,、模糊不清、條帶拖尾的現(xiàn)象,。DNA片段越大,，這種現(xiàn)象會越明顯。

需要補充的一點是,，并不是所有出現(xiàn)條帶拖尾的現(xiàn)象,，都代表樣品量過載，也有可能是含有其他雜質(zhì)或樣品降解造成的,。

（九）點樣孔內(nèi)出現(xiàn)很亮的條帶,，且不動，是什么原因,？

DNA分子在電壓的推動下,，會向前移動，但如果其分子量非常大,，體積也就會變得很大,，以至于無法穿過瓊脂糖向前移動。

如果在基因組DNA提取后,，樣本中含有蛋白質(zhì),，那么就很可能出現(xiàn)這種現(xiàn)象。其原因在于基因組中有大量的組蛋白和DNA纏繞在一起,，如果提取過程中去除不干凈,，這些蛋白就會和DNA一起進(jìn)入后續(xù)電泳中。

而蛋白在瓊脂糖電泳中，無疑是體積超標(biāo)了,，因此整個孔內(nèi)的DNA也無法移動出去,。

以下，我們還整理了一些過往制作的關(guān)于瓊脂糖凝膠電泳的視頻,，有的是實驗原理,，有的是實驗操作，希望對你有幫助,。

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